淺析乳制品中芽孢菌的檢測

◎ 韓秋紅，李 琴，李凱鋒

（1.農業部乳品質量監督檢驗測試中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150090；2.黑龍江省完達山乳業股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150087）

牛奶的組成接近于人體母乳，因此人體很容易消化和吸收牛奶的營養成分。牛奶的營養成分主要包括水分、蛋白質、脂肪、碳水化合物、礦物質和維生素等[1]。牛奶良好的營養也適宜微生物生長。據報道，芽孢桿菌屬在原料乳中污染最嚴重。芽孢是某些細菌在生長發育后期，在細胞內形成一個圓形或橢圓形的抗逆性休眠體[2]。農場中的飼料、土壤和糞便等易受芽孢菌污染，牛舍周圍也廣泛存在芽孢菌[3]，這些菌易污染奶牛乳頭表面，使原料乳污染芽孢菌。當原料奶中有較多的芽孢時，加工后貯存過程中芽孢轉化為營養體，隨著貯存期的延長會出現酸包、脹包現象[4]。作為乳與乳制品中的風險監測項目，芽孢菌檢測十分重要。目前國內檢測乳與乳制品中芽孢菌的權威方法為農業行業標準NY/T 1331-2007中第二部分需氧芽孢總數測定方法，本文對該檢測方法進行解讀并重點分析檢測的注意事項。

1 檢測原理

利用微生物能夠生長和繁殖的特性，使微生物由肉眼看不見的微小個體變為肉眼可見的菌落。

將樣品加熱處理以除去非芽孢菌，然后向樣液中加入能為芽孢菌提供豐富營養的乳平板計數瓊脂培養基（MPC培養基），放入合適環境下培養，最后計數。

2 稀釋液和培養基的作用與使用要求

（1）蛋白胨-鹽溶液各組分作用。酶水解酪蛋白胨既為芽孢菌提供氮源，又為其提供生長因子；氯化鈉能平衡芽孢菌的滲透壓。

（2）磷酸鹽緩沖液的作用。磷酸鹽緩沖液調節鹽平衡，還可緩沖調整液體pH。

（3）MPC培養基各組分作用。酵母浸膏可給芽孢菌提供豐富的B族維生素；胰蛋白胨既是芽孢菌中氮的來源，又是芽孢菌中碳的來源；葡萄糖是芽孢菌的能源物質；脫脂奶粉使整個培養基體系更接近乳制品，還原芽孢菌的生長環境。

（4）MPC培養基使用要求。①若滅菌后馬上使用，則滅菌后將其冷卻后放入45 ℃水浴中。②滅菌后需要貯存，則將其冷藏存放于暗處，存儲時間應小于30 d。③若使用前加熱融化培養基，則將融化好的培養基放于水浴中，水溫為45 ℃。

3 設備、材料及注意事項

①微生物實驗室常用設備和材料及（36±1）℃培養箱、（45±1）℃和（80±1）℃水浴鍋，無菌的培養皿、吸管（或移液器及槍頭）以及試管。②應注意培養皿等物品的清潔無菌狀態，且不含有抑菌的任何成分。③推薦使用微量移液器及吸頭，若使用吸管則不允許用嘴去吸吸管。④應注意使用的微量移液器是否可高壓滅菌，是否檢定或校準。⑤培養箱及計量設備應按規定做檢定或校準及進行期間核查，注意利用并及時更新修正因子。

4 具體操作及注意事項

4.1 檢樣處理及注意事項

4.1.1 檢樣處理

稱取固態樣品10 g（或25 g），加入90 mL（或225 mL）稀釋液（蛋白胨-鹽溶液或磷酸鹽緩沖液）中混勻，制成10-1的初級稀釋液。

4.1.2 注意事項

①注意對樣品外包裝處理的要求，保證樣品外包裝進入無菌室前清潔。②注意樣品混勻（“三個混勻”之一），如混勻液體樣品可將其翻轉25次，避免形成泡沫。③注意稱樣要準確。④注意溶解固體樣品的稀釋液應預熱至45 ℃。⑤注意樣品與稀釋液要混勻（“三個混勻”之二）。若手動振搖稀釋液，應保證液體在7 s內以30 cm振幅進行25次往返振搖。

4.2 加熱處理及注意事項

4.2.1 加熱處理

準備好（80±1）℃水浴，將5～10 mL液體樣品，或5～10 mL固態樣品初級稀釋液，放入滅菌后的試管中。把試管立刻放入水浴加熱10 min，取出立刻冷卻于低于20 ℃的流水中。

4.2.2 注意事項

①向試管中加樣液不得碰觸超出水浴水面的試管內壁，也不得碰觸水面以下2 cm以內的試管內壁。②吸樣量要準確。③吸液時，不同規格的吸頭浸入液面的合適深度不同。使用規格為200 μL～2 mL的吸頭浸入液面深度應為3～6 mm；使用規格為大于2 mL的吸頭浸入液面深度應為6～10 mm，吸液后吸頭要停留在液面下1 s。控制勻速吸液以防止帶入氣霧污染樣品、液體沖入移液器套柄損傷密封圈和活塞以及吸液過程形成氣泡。④水浴中的水面應比試管內樣液面至少高出4 cm。⑤每次檢測準備一個對照管，向對照管中吸入奶樣后放一支溫度計，以測定奶溫。⑥試管內樣液應在5 min內完成升溫。

4.3 進一步稀釋液的制備及注意事項

取1 mL熱處理冷卻后的樣液，加入裝有9 mL稀釋液的試管中搖勻，得到10倍稀釋樣液。如此再做稀釋，每次遞增10倍。

注意事項：①吸取每一稀釋度樣液，應使用單獨的吸管或吸頭。②應保證稀釋液滅菌后的準確體積。③將樣液轉入稀釋液試管時，吸管或吸頭頂端不可碰觸稀釋液面。

4.4 接種和培養及注意事項

4.4.1 接種和培養

樣液培養后計數有10～150個菌落認為是選擇了合適的稀釋度。做遞增10倍稀釋的同時，取該合適稀釋度液體兩個1 mL加入兩個培養皿內。立刻向培養皿中傾倒MPC瓊脂12～15 mL混勻。同時做空白試驗（加入1 mL稀釋液和培養基于培養皿中混勻）。培養基凝固后倒置，于（36±1）℃堆疊培養皿培養（48±2）h。

4.4.2 注意事項

①可依據經驗或產品標準限量值選擇合適的稀釋度。②傾倒培養基時保證所用的培養基溫度約45 ℃。溫度過高，會在平板蓋上聚集水蒸氣，如不及時翻轉平板，凝結的水蒸氣落入瓊脂，造成菌落游走或擴散（有可能長成整個平板是一個大片菌），使計數困難，甚至菌與菌相互污染。培養基溫度過低會變為固體或半固體狀態，影響培養基與樣品均勻混合。③加入樣液后及時向培養皿中傾注培養基。傾注培養基后不要急于封蓋。④樣液與培養基要混勻（“三個混勻”之三）。應關注培養基與樣液的混勻程度，混合時平板可按前后左右、順時針、逆時針等方向分別晃動，直至沒有明顯的白色底及白色云狀物。⑤傾倒培養基于培養皿并混合均勻后應水平放置待其凝固。⑥培養基凝固后立即倒置平板。⑦限制操作時間。應在15 min內完成從熱處理結束到傾注培養基混勻的操作。⑧可用空培養皿加入培養基作對照試驗，以檢查操作過程中的無菌性。空白和對照試驗培養后應均無菌落生長。⑨為防止菌落蔓延可在培養基凝固后再次加入一薄層培養基，或培養皿上蓋里放一張有少許甘油的濾紙。⑩培養時間的一致性，培養溫度的均勻性，培養箱放置位置要使其外壁避開陽光直射；培養箱內物品避免填充過滿，保證培養箱內空氣流通，培養皿與培養箱內壁距離≥25 mm，培養皿疊放在培養箱內每疊≤6個，各疊培養皿間距離≥25 mm。

4.5 菌落計數及注意事項

4.5.1 菌落計數

肉眼對培養皿計數菌落數，必要時可借助放大鏡。蔓延的菌落計做一個菌落，若菌落蔓延部分大于培養皿底部的1/4則不應計數，若菌落蔓延部分比培養皿底部的1/4小，則計數培養皿中無蔓延菌落部分后，按比例計算出整個培養皿的相對結果。

4.5.2 注意事項

①計數時不要將極微小的菌落遺漏。②應識別出多個混合的菌落。③應識別培養皿上的氣泡和樣品等的雜質。④當培養皿上出現菌落間呈鏈狀生長，且沒有明顯界線，應將一條單鏈作為一個菌落。⑤蔓延的菌落可能是爬行或菌落鏈、瓊脂表面水膜和皿底水膜。

5 計算結果及注意事項

保留的培養皿應含有10～150個菌落，計算后保留兩位有效數字。樣品中需氧芽孢總數[CFU/mL（g）]＝保留培養皿中菌落計數總和÷（保留的第一個稀釋度的培養皿個數+0.1×保留的第二個稀釋度的培養皿個數）×保留的第一個稀釋度的稀釋倍數。

注意事項：①計算結果以整數計，修約原則為“四舍五入”法。結果既可以用10的指數報告，也可以取前兩位有效數字后，用0來補位。②若每個稀釋度培養皿中菌落數均為＜10，則以“＜10×最低稀釋度的稀釋倍數CFU/mL（g）”計。③若每個稀釋度培養皿中都有150個以上菌落數，則以“＞150×最高稀釋度的稀釋倍數CFU/mL（g）”計。④注意培養皿菌落計數結果偏差。本人重復計數結果偏差應≤8%，雙人計數結果偏差應≤10%。常見的不符合原因有：視力疲勞、注意力不集中、未充分辨認菌落，可通過避免長時間連續進行菌落計數、養成專心習慣、借助放大鏡或菌落計數器進行計數等方法，使菌落計數更加準確。

6 檢畢物品的廢棄注意事項

①計數后的平皿應使用高壓滅菌容器將其滅菌處理后，才能洗刷。②報告檢測結果后，才能處理檢樣。

7 總結

芽孢菌檢測的每一步操作過程都要密切注意無菌操作。①應注意檢測中使用的培養皿等物品的清潔無菌狀態，且不含有抑菌的任何成分。②注意培養基配制中其成分的有效性。③注意使用的微量移液器是否可高壓滅菌，是否檢定或校準。④注意樣品要混勻、樣品與稀釋液要混勻、樣液與培養基要混勻。⑤應在15 min內完成從熱處理結束到傾注培養基混勻的操作。正確規范地對芽孢菌進行檢測，可以對乳制品質量準確評估，為我國乳與乳產品的健康保駕護航。