健康甜菜根際土壤中細菌群落結構的研究

桑雨菲

摘 要：甜菜是我國北方（包括西部）地區的重要糖料作物，當前我國甜菜種植面積大概有20萬畝。連年的甜菜種植，出現的根腐病會直接導致甜菜含糖量降低，產量減少，嚴重時甚至絕產。生物防治甜菜根腐病作為環境友好型防治措施，正在被廣泛關注。針對目前尚缺乏對甜菜根際土壤中細菌群落結構的研究，本研究采用稀釋涂平板分離方法，將采自內蒙古烏蘭察布市集寧區健康甜菜的根際土樣中菌株進行分離；通過16S rRNA的PCR擴增測序，測出土壤中細菌；并利用進化樹顯示出其親緣關系。共分離出30株細菌，鏈霉菌屬15株，芽孢桿菌屬9株，節桿菌屬1株，葉桿菌屬1株，綠膿桿菌屬1株，冢村氏菌屬1株，貪噬菌屬1株，黃桿菌屬1株。冢村氏菌屬細菌菌落總數（CFU）最多；鏈霉菌屬菌株數量最多。希望能為生物防治甜菜根腐病提供一定依據，從而達到甜菜增產、農民增收的目標。

關鍵詞：甜菜根腐病；土壤根際細菌；菌株鑒定；PCR

中圖分類號：S435.663 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）22-0214-03

1 引言

甜菜是我國北方地區的重要糖料來源，也是世界上重要的糖料作物。甜菜有喜溫涼氣候，耐寒、耐旱、耐堿等特性。我國甜菜種植面積大概有20萬畝，主要分布在北緯40°以北各省區。在連年種植甜菜的產區，根腐病會使甜菜含糖量降低，產量減少10%-40%，嚴重時甚至絕產。由于甜菜根腐病帶來巨大經濟損失，近年來越來越引起人們重視。甜菜根腐病可以由多種真核、原核病原菌引起，我國引起甜菜根腐病主要病原菌有鐮刀菌（Fusarium spp.）絲核菌（Rhizoctonia spp.）、絲囊菌（Aphanomyces spp.）胡蘿卜軟腐歐文氏菌甜菜亞種（Erwinia carotovora subsp.carotovora）和莖點屬真菌（Phoma spp.）等。土壤排水不良、板結、肥力不足，害蟲猖獗，甜菜重茬，根發育不良，人為造成傷口等都可能誘發甜菜根腐病。甜菜根腐病為土傳病害，因為引起該病的病原物多而復雜而且在病害大量發生以前很難察覺，因此防治起來有一定難度[1-2]。

通過選育抗病品種防治甜菜根腐病是最經濟有效的方法，但現在國內大部分地區還沒有可大面積推廣的高效抗病品種。農業防治措施主要以預防為主，在根腐病發生時無法有效治理。化學農藥對甜菜根腐病防治有很好的效果，但有使病原菌產生抗藥性、造成環境污染、殺死土壤中有益微生物、威脅人類健康等缺點。生物防治是環境友好型防治措施，同時，因其對多種病原菌有效而引起廣泛關注。

近年來有一些關于甜菜根腐病的生防菌的研究：Webb的實驗表明菌株Hall and R47對復雜的土傳病害有一定防治作用并且可以增加甜菜產量[3]。Heidi等在溫室實驗中發現Trichoderma harzianum可以降低小麥和甜菜的猝倒病和根腐病[4]。Thilagavathi表明在盆栽實驗中Pseudomonas.fluorescens （Pf1）和T.asperellum（TTH1）聯合使用可以顯著減少由Sclerotium rolfsii引起的甜菜根腐病[5]，同時可以增加產量。但卻沒有研究指出健康甜菜土壤中細菌種類及其親緣關系。因此，我希望通過本研究能指出患甜菜根際土壤中細菌種類，并以進化樹表示其親緣關系。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 土壤樣品

待測土壤實驗室自行分離保存（裝入密封袋，保存于4℃冰箱中），用于實驗的土樣采集于內蒙古烏蘭察布市集寧區健康的甜菜田。

2.1.2 培養基

NA培養基：量1L水于量杯中，稱取蛋白胨和NaCl各5g，牛肉浸膏3g（將稱量紙與牛肉浸膏一起放入量杯，在稱量紙破損前用玻璃棒挑出），葡萄糖2.5g，瓊脂18g，用pH計調酸堿度到中性。

2.1.3 主要儀器設備

超凈工作臺、PCR儀、超低溫冰箱、海爾冰箱、渦旋振蕩器、30℃恒溫培養箱、電泳儀、離心機、pH計、磁力攪拌器、瓊脂糖水平電泳槽。

2.2 方法

2.2.1 土壤中細菌的分離及保存

將土壤樣品用篩子篩，樣品進行10-1到10-4梯度稀釋。在10ml離心管中稱1g土樣加9ml無菌水，充分震蕩混合。用移液槍吸1ml上述液體于離心管中再加9ml無菌水充分搖勻，重復該步驟2次。獲得10-4土壤樣品稀釋液，滴30μL于NA平板上，重復三次。用封口膜封口后放入30℃恒溫箱。待出現單菌落后，將長的不同的菌編上不同數字，并記錄各編碼菌CFU。用接菌環挑取有編號的菌，在NA平板上擴繁。用封口膜封口后放入30℃恒溫箱，2-3天后平板上長出菌，將平板上的菌體用槍頭刮取，分別保存在二個加800μL30%甘油和800μL LB液體培養基的凍存管中，放入-80℃超低溫冰箱中保存。

2.2.2 菌液PCR

配制菌液：在超凈工作臺中，用槍頭蘸取少量菌體后，置于裝有20μL無菌水的PCR管中，晃動數下后拿出。

選用16S rRNA通用引物63F、1387R（引物序列見表2）進行PCR擴增，擴增體系見表1。PCR反應程序為：95℃10 min，94℃ 40s，55℃30s，72℃ 1 min30s，30個循環；最后 72℃延伸10min。PCR擴增后，用1%瓊脂糖凝膠進行檢驗，條帶正確后移送北京擎科新業生物技術有限公司測序。

2.2.3 系統進化樹的制作

將基因序列輸入NCBI數據庫，進行比對，得到相近的菌種。在LPSN數據庫中，查找菌株的有關文獻及其系統進化樹。將文獻中相近菌株的編號輸入NCBI數據庫，得到相近菌的基因序列。將原菌、相近菌株的基因序列輸入軟件Mega5中，生成系統進化樹。

3 結果

3.1 測序結果

共30株菌株測序成功，得到北京擎科新業生物技術有限公司測序報告——編碼16S rRNA的有關基因序列。

以B2B-15及其相關菌株為例（其余序列見附錄）：

>B2B-15_TSS20170828-010-5844.seq.Contig1

TTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGACTGGTTTTATGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTTTGTACCAGCCATTGTATGACGTGTGTAGCCCCACCTATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTAAATGTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTACGGTTCTCTTTCGAGCACTAAGCCATCTCTGGCGAATTCCGTACATGTCAAAGGTGGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTTCGTTACTGAGTCAGTGAAGACCCAACAACCAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTACAGGCCCAGGGGATTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCGCATATCTACGCATTTCACTGCTACACGCGGAATTCCATCCCCCTCTGCCGTACTCCAGCAATGCAGTCACAGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACAACTGTCTTACATTACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTACGGTACCGTCATTAGCCCTCTTTATTAGAAAAGGCCGTTTCGTTCCGTACAAAAGCAGTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCCTGCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACAGATCGAAGGCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTACCTAATCTGCCATCGGCCGCTCCATTCGCGCAAGGTCTTGCGATCCCCTGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAGCACAGCTTTCGCTGCGTTATCCCCCACGATTGGGCACGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCC

3.2 培養菌落

在30℃恒溫箱培養三天后，觀察到菌落如圖1。

3.3 培養個數

在30℃恒溫箱培養三天后，觀察到不同菌株的個數如表3。

4 討論

本實驗將從土壤中分離的30株菌株進行16S rRNA的PCR鑒定，為健康甜菜土壤中細菌群落結構研究提供參考依據，但僅僅局限于可培養細菌且分離的菌株較少。經16S rRNA基因片段測序鑒定后表明：鏈霉菌屬15株，芽孢桿菌屬9株，其余屬各一株。從細菌菌落數量來看，冢村氏菌屬最多；從菌株種類來看，鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬數量多。其中，芽胞桿菌是一種比較理想的生防菌，其具有易分離、生長繁殖速度快等優點。此外，芽孢桿菌有芽孢保護，具有較強抗不利環境條件的能力，對菌劑生產運輸要求低，且與化學農藥混合使用或接觸時穩定性好生存能力強。

5 結論與建議

5.1 結論

從土壤中分離并保存的30株菌株分布在8個屬中，其中，鏈霉菌屬15株，芽孢桿菌屬9株，節桿菌屬1株，葉桿菌屬1株，綠膿桿菌屬1株，冢村氏菌屬1株，貪噬菌屬1株，黃桿菌屬1株。從細菌菌落數量上看，B2B-1數量最多，屬冢村氏菌屬。

5.2 建議

根腐病對經濟、環境都有巨大的害處。為減少這些危害發生，應注重基礎研究，避免甜菜大面積減產、絕產，保障農民的正常收入。在防治根腐病方面，應避免化學制劑的過量使用，減少對土地、環境等危害，盡量進行環境友好型的生物防治。

6 創新與展望

6.1 創新點

找出健康甜菜土壤中細菌種類，并做出進化樹以表示其親緣關系。為甜菜根腐病的生物防治提供依據。

6.2 展望

由于本次研究時間較短，很多內容還有待進一步提升。本實驗中僅選取了內蒙古烏蘭察布市集寧區甜菜根際土壤，若能增加取樣地點，可能會減少實驗誤差。

下一步，本研究希望通過拮抗試驗等方式找到甜菜根腐病的生防菌，如果條件允許，希望能制出微生物菌劑，使甜菜的生物防治應用到農田里，令農民豐產豐收，生活富足。

7 致謝

首先感謝學校和科技俱樂部，給我這個機會，解答了我一直以來的問題，同時學到很多知識、技能，相信這在我今后的人生道路中會很有幫助。其次感謝我校內的指導老師曹仁明老師，在我陷入低谷期的時候給予我鼓勵和幫助，感謝王琦老師及實驗室的師兄師姐，在專業知識上給予我很大幫助。

參考文獻

[1]Harveson R.M.， Hein G.L.， Smith J.A.， Wilson R.G.， Yonts C.D. 2002. An integrated approach to cultivar evaluation and selection for improving sugar beet profitability： a successful case study for the Central High Plains. Plant Disease，86：192-204.

[2]Harveson R.M.， Rush C.M. 2002.The influence of irrigation frequency and cultivar blends on the severity of multiple root diseases in sugar beets.Plant Disease，86：901-908.

[3]Webb， K.M.， Harveson， R.M. and West， M.S. 2015.Evaluation of Rhizoctonia zeae as a potential biological control option for fungal root diseases of sugar beet. Annals of Applied Biology，167（1）：75-89.