新型輪狀病毒反向遺傳學系統的開發及應用

葛 雨，冉旭華，聞曉波

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

輪狀病毒（rotavirus，RV）是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬重要成員，是導致嬰幼兒和幼齡動物腹瀉的主要病原體之一。RV的基因組由11個獨立片段的dsRNA組成，編碼6種結構蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7）和5/6種非結構蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/NSP6）。人們對RV 11個基因片段功能、作用機制研究并不透徹，且不同毒株之間，重配、重排事件的不斷發生，很難有目的地、精確定位地改造基因的精細結構以確定這些變化對表型性狀的直接影響。由于缺乏完全基于質粒的反向遺傳學系統，阻礙了對RV復制和發病機制的深入研究。

反向遺傳系統是指直接從生物的遺傳物質入手來闡述生物生命發生的本質現象[1]。可以設計個別病毒基因中的特定突變，產生感染性病毒顆粒并探索其表型。RNA病毒的反向遺傳系統涉及在cDNA基礎上操作其基因組，需要將cDNA轉染后，拯救具有感染性的活的子代病毒（野生型或突變型）。在最初的研究中使用了輔助病毒的共感染或雙重感染。但是，由于攜帶工程化基因組的病毒顆粒可能很難從輔助病毒中分離出來，因此最終目的是創建僅含質粒或僅含RNA的反向遺傳學系統，無需輔助病毒，它可以將工程化突變的表型變化精確表現。1990年有人提出開發RV反向遺傳系統，經過20多年的研究[2]，如今已成功建立了僅RV 11個片段質粒的反向遺傳系統，現將最新研究進展及其應用作以綜述。

1 輪狀病毒反向遺傳系統的研究進展

1.1 模板依賴性體外R V R N A復制系統建立1990年，首次確定RV SA11株全基因組核苷酸序列[3]后有研究人員提出克隆用于測序的cDNA，并希望從克隆的cDNA中獲得具有感染性的病毒粒子，進行RV反向遺傳系統的開發。1994年Chen D等[4]建立了“模板依賴性體外RV RNA復制系統”，該系統在RV正鏈模板RNA上啟動并合成全長雙鏈RNA。許多研究者推測RV反向遺傳學系統將會很快成功。然而，接下來的數年世界各地的研究者們雖然進行了深入的嘗試，卻沒有利用這個系統獲得任何重組輪狀病毒。

1.2 輔助病毒驅動的反向遺傳學系統的建立2006年，Komoto等[5]根據輪狀病毒在體內的復制周期，提出一個理論：“應當識別并復制源自cDNA（已感染野生型輪狀病毒）的正鏈RNA，通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）產生dsRNA，獲得來自cDNA具有感染性的輪狀病毒。這為反向遺傳系統的研究提供了一個理論基礎。2010年Troupin等報道了基于重排基因片段的優先包裝RV的反向遺傳學方法，該方法是通過利用輔助病毒來分離單基因替換的重組RV。2013年Richards等[6]在此基礎上使用獨立的選擇機制產生了含有NSP2基因片段的重組病毒。在輔助病毒驅動的反向遺傳學系統中獲得了重組的RV[7-8]。雖然這種反向遺傳系統在技術上是有限的，只能拯救部分片段的感染性，拯救效率也并不高，且需要輔助病毒的參與，重組的病毒難以區分開輔助病毒和輪狀病毒，且在之后試驗研究中也并沒有用此方法再次獲得重組病毒。但在此項試驗中改變了輪狀病毒基因組，獲得了含有由cDNA衍生的VP4[9]、NSP2[10-11]和NSP3[10]基因片段的重組RV。這一成果為RV的基因工程研究打開了大門。

1.3 輔助質粒驅動的反向遺傳系統的建立2017年Yuta Kanai等[12]在前人研究基礎上開發了完全基于質粒的RV反向遺傳系統，針對已建立的呼腸弧病毒科病毒反向遺傳學系統，做了2個重要的修改，加入病毒融合的相關小跨膜蛋白（FAST）和減毒痘病毒（VV）加帽酶（D1R和D12L[13-15]）。FAST是唯一已知的未包膜病毒融合體[16]，可在體內促進病毒復制[17]。另外，由于RV mRNA 3'末端不是聚腺苷酸化的，將VV加帽酶用于重組的RV[18-20]中，T7pol轉錄物被VV加帽酶有效地封閉在細胞質中，從而提高翻譯效率。Kanai等將RV的11個基因區段，以及編碼FAST和VV加帽酶D1R和D12L的14個質粒共轉染細胞，獲得了重組病毒。在試驗中為了排除與親代病毒污染的可能性，在NSP1-NSP4基因區段設計了獨特的酶切位點（作為遺傳標記），排除了親代病毒可能性。對RTPCR產物的直接測序，證實rSA11是來自cDNA的重組病毒，且其電泳型與天然SA11的電泳型無差別。病毒的復制動力學和峰值滴度測試結果也表明天然和重組病毒具有類似的復制特征[12]。同時Kanai等利用新開發的反向遺傳學系統獲得的重配病毒rSA11/KU VP6，和天然SA11的病毒表現出相似的復制動力學。獲得的重配病毒是未曾報道過的，是從此次反向遺傳系統中獲得的獨特遺傳組合[12]。

1.4 無需輔助質粒的 R V的反向遺傳系統建立2017年Komoto等[21]開發的完全基于質粒的RV反向遺傳學系統已經取得了巨大的進步，但后續的研究發現VV加帽酶（D1R和D12L[13-15]）兩種表達的質粒共轉染對于獲得重組病毒不是必需的，因此2018年Komoto等[22]將此方法進行了優化。在共轉染時將其中一個片段的質粒相對其他質粒的3倍進行轉染進行對比，發現分別在NSP2和NSP5的轉染量增加時，病毒滴度增加。基于這個發現又將NSP2質粒和NSP5質粒轉染量進行倍數增加對比，發現在NSP2質粒轉染量增加3倍和NSP5質粒轉染量增加5倍時重組病毒的拯救效率較好，成功建立了不需要輔助質粒的RV的反向遺傳系統。該系統僅用RV的11個基因片段的質粒共轉染BHK-T7細胞，獲得源自cDNA的重組RV。雖然NSP2質粒和NSP5質粒轉染量增加提高了病毒拯救效率，但其機制仍不清楚，需要進一步的研究。

2 RV反向遺傳系統的應用

2.1 R V反向遺傳系統在 R V致病機制研究中的應用

2.1.1 研究RV NSP1 C端區域功能在RV中NSP1可以通過促進IFN調節因子3（IRF3）的降解來拮抗干擾素（IFN）信號[23]，可利用反向遺傳傳系統分析C-末端截短的NSP1突變病毒在先天性免疫應答中的作用。2017年Kanai等利用基于14質粒的反向遺傳系統，分別構建重組NSP1（rSA11）的RV和C-末端截短的NSP1突變體（rSA11-dC103），證明了NSP1的C-末端區域是其通過拮抗IRF3來抑制IFN信號傳導所必須的[23-25]。

2.1.2 研究RV NSP6在病毒復制中的作用RV非結構蛋白NSP6存在于絕大多數輪狀病毒毒株中，因此一些研究人員認為NSP6蛋白有利于增加病毒的復制。然而，在病毒復制周期中沒有直接的證據能表明其功能及其必要性。2017年Komoto等[21]利用基于14質粒的RV反向遺傳學系統獲得重組的RV（rSA11）和NSP6缺陷型重組病毒，以研究NSP6在病毒復制周期中的功能。通過病毒生長曲線發現RV NSP6缺陷型病毒復制周期比rSA11慢，但是最終可以達到一個相近的病毒滴度。噬斑形成結果表明NSP6缺陷型病毒形成的斑塊較小。證實了雖然NSP6蛋白可以有效地促進病毒生長，但NSP6蛋白對細胞培養中的病毒復制不是必需的。

2.2 用于外源基因的表達

2.2.1 輔助質粒驅動的反向遺傳系統在外源片段表達中的應用2001年Patton等研究發現，NSP1基因片段對病毒復制沒有顯著影響。在此基礎上，2017年Yuta Kanai等[12]在基于14質粒的反向遺傳系統中，利用分裂綠色熒光蛋白系統GFP（48 bp）標記NSP1，用以確定是否能夠利用反向遺傳系統拯救表達了外源小片段的RV。GFP包括GFP1-10檢測器片段和GFP11標簽片段通過自動組裝能力來恢復完全熒光信號[26]。在重組NSP1 ORF的C-末端引入GFP11片段結果表明在細胞中表現出與重組病毒類似的復制動力學；觀察GFP信號，GFP1-10與NSP1-GFP11仍有高效互補產生特定的GFP信號的功能[12]。rNSP1-GFP11蛋白分散在感染細胞的核周區域，與天然NSP1的分布相同[12]，證明NSP1基因片段對病毒復制沒有顯著影響，與前人研究一致[27-29]。GFP的成功表達，說明小片段的插入對重組病毒并沒有影響，可將其應用于深入探討RV結構特征的研究。

在進行小片段插入成功后，又進行了較大片段的插入嘗試，在重組RV NSP1片段上插入NanoLuc螢光素酶（NLuc）（516 bp），成功拯救了表達NLuc的重組病毒（rSA11-NLuc）。試驗中發現，rSA11-NLuc可在細胞中連續傳5代保持不變，這種遺傳穩定性可應用于RV感染時體內的追蹤。Smee等[30]還用已知的RV抑制劑利巴韋林對rSA11-NLuc進行抗病毒篩選。在有效劑量內細胞無病理變化，在小劑量使用時，發現利巴韋林對rSA11-NLuc有劑量依賴性抑制，該研究表明rSA11-NLuc可用于新型抗病毒藥物的篩選[12]。

2.2.2 無需輔助質粒的RV反向遺傳系統在外源片段表達中的應用2018年Komoto等[22]在基于無需輔助質粒的反向遺傳系統上，進行外源片段的插入，利用該系統獲得重組的SA11（rSA11），將來自豬瘟病毒具有自我切割功能的2A肽序列（幫助病毒翻譯、復制）和NanoLuc螢光素酶（NLuc）連接獲得2A-NLuc，替換NSP1 ORF的N-末端獲得rSA11-2A-NLuc重組RV病毒，并確定了2A-NLuc替換NSP1 ORF的N-末端不會阻斷病毒的復制但復制效率略低，噬斑尺寸較小；同時rSA11-NLuc和rSA11在細胞中連續10傳代，通過PAGE和熒光素酶分析，確定了rSA11-NLuc對NLuc表達的遺傳穩定性是保持不變的。rSA11-2A-NLuc的成功拯救，證明了無需輔助質粒的反向遺傳系統也可應用于外源片段的表達。基于這一發現，Komoto等嘗試在NSP1插入更長的外源基因片段（EGFP和mCherry），其重組NSP1片段的大小分別為1 994 bp和1 982 bp，在感染細胞中連續傳代10次仍能檢測到，再次證實其穩定的遺傳性。這為RV分子生物學的研究、開發新疫苗、構建載體作了重要的補充。

3 展望

RV反向遺傳學系統，自1994年有人提出開發起，經過數十年的研究，在2018年終于成功建立一種無需輔助病毒、無需輔助質粒且高效、簡化RV反向遺傳系統，在新的抗RV病毒藥物的篩選、新型活疫苗的開發等具有巨大的應用價值；并且可以解決RV的基本分子生物學問題，如“定做”的遺傳變化引起的表型變化、宿主范圍限制、病毒致弱等方面都具有重要意義。該新型RV的反向遺傳操作系統是研究RV的細胞侵入、病毒基因和蛋白合成、病毒釋放以及致病機制的強有力“武器”，將極大地加快RV相關領域的研究步伐。但是，利用該項反向遺傳系統的工作機制仍不清楚，例如雙鏈RNA的合成，是否與藍舌病的反向遺傳系統具有相似之處；對于來自不同群的RV基因片段的反向遺傳拯救工作仍未成功；另外，提高NSP2和NSP5質粒轉染量為什么就不需要輔助質粒參與就可以完成RV拯救，這一機制尚不清楚，仍需要進一步的研究。