食源性微生物的檢測方法

◎ 張雪穎

（蘇州大學 劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123）

食品安全是公眾最為關注的焦點之一。食源性病原菌，如單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬和空腸彎曲桿菌等廣泛存在并與疾病爆發密切相關。盡管食品加工技術的改進和嚴格的工業衛生環境限制了微生物的致病性，但食源性疾病的爆發仍在繼續。由微生物和生物化學活性引起的食物腐敗對食品工業造成極大的經濟損失，因此，有效地檢測原料、食品加工環境和最終產品中引起疾病和腐敗的微生物對于預防食源性疾病的大規模流行和資源的損失至關重要。

1 常規檢測方法

食品行業采用常規微生物檢測方法，觀察人工培養基中細菌的生長。通常需要預富集步驟以成功地從復雜食物系統中分離目標微生物。預富集之后，將樣品鋪板在固體培養基上，再選擇的溫度和氣氛下孵育。最后，根據各種生化和/或免疫學特征鑒定分離物。許多生長培養基可用于選擇性檢測食源性病原體和腐敗生物。整個過程需要5～7天。

常規方法費時費力，這為許多工業應用帶來了不便，特別是在今天的全球分銷市場上。食品中的微生物可進入休眠狀態或損傷狀態，并在檢測培養基上變得不可培養；這將導致低估污染水平，或未能將病原體與污染樣品隔離。開發恢復方法以復蘇損傷的食源性微生物，對于準確的數據分析具有重要意義。一些恢復步驟利用修復試劑來恢復細胞損傷，然而除了額外的時間消耗，受傷的細胞可能無法充分恢復，從而需要新的方法來檢測非受傷和受傷的生物體以防止假陰性結果。

2 生化鑒定方法

快速準確地鑒定從食物樣品中分離的病原體對于質量保證和食品安全問題源頭的快速識別具有重要意義。微生物的生化自動識別系統被廣泛應用于食品微生物實驗室。自動化系統減少了鑒定分析的時間，增加了被分析樣品的數量，提高了各種分析的準確性。因此，自動化已經用于許多流行病的診斷，其現正與微型生化試劑盒一起使用。此類試劑盒用于鑒定常見的食源性病原體，如腸道細菌、彎曲菌、李斯特菌、沙門氏菌等。微型裝置由一次性裝置組成，該裝置含有15～30個培養基或特異性滴定的底物以鑒定特定的細菌群或物種。儀器的進步使得套件的自動化系統成為可能，這些自動化儀器孵育細菌，監測生化變化，為任何富集群體生成表型譜，并通過比較配置文件與已知的配置文件來識別細菌。另一種分析細菌組成或代謝特性的自動細菌鑒定系統，如脂肪酸譜或碳氧化譜，被用于病原體檢測。與傳統方法相比，這些系統具有一些重要優勢，包括減少人工，減少人為錯誤，增加樣品通量及更快的周轉時間。

3 免疫鑒定法

抗原和抗體之間的高度特異性結合，特別是單克隆抗體，促進了各種免疫學檢測的發展。免疫分析方法簡單，用途廣泛，是一組快速病原體檢測方法，可用于食品和環境的檢測。免疫學分析包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、顆粒凝集法（LA）、免疫沉淀法、免疫熒光顯微鏡和免疫傳感器法。

3.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA是目前應用于食品病原體檢測的最成熟的免疫學技術。ELISA被描述為“三明治”試驗，與傳統的培養方法相比，大多數ELISA檢測所需時間病毒為1 h，細胞小于36 h。沒有預富集時ELISA的靈敏度范圍只有103～105個細菌細胞，不足以檢測導致低水平污染的致病性細菌細胞。

3.2 顆粒凝集法（LA）

LA是最簡單的免疫分析方法，微孔中的抗體包被顆粒與來自血清或來自食物的純培養分離物樣品的稀釋液共同孵育。如果樣品中含有要篩選的標記，就會檢測到顆粒的凝集。一種名為反向被動乳膠凝集（RPLA）的LA修飾物可以檢測可溶性抗原。RPLA主要用于檢測食品提取物中的毒素或純培養物中的毒素。

3.3 免疫沉淀法

免疫共沉淀是基于“三明治”程序。樣品被直接裝入含有附加膠體金標記抗體的室內，當樣品擴散到固體基質后，任何抗體識別都會導致可檢測的顏色變化。該方法快速、簡便。結果可以在10 min內讀取，無需任何其他操作。然而，該程序需要一個漫長的預富集步驟。

3.4 免疫傳感器

免疫傳感器通過將反應固定在被稱為換能器的固體表面上來檢測抗原-抗體結合。經過特定的綁定后，傳感器將表面變化參數轉換為可檢測的電信號。許多研究已經探討了應用新型免疫傳感器技術檢測和計數食源性病原體的潛力。這種方法在幾個小時內就會產生結果，類似于經典ELISA。免疫傳感器是便攜式的，產生可讀的數字信號而無需人工操作。然而大多數免疫傳感器需要昂貴的設備和較長的前期準備。

3.5 免疫磁分離（IMS）

免疫磁分離（IMS）是一種能增強免疫分析和改善上述問題的替代方法。IMS對磁性珠的特異性抗體進行配對，并有效地從食物基質中捕獲目標細菌細胞。大多數情況下，IMS與其他檢測方法相結合，如ELISA、磁力顯微鏡、PCR或平板計數等，以提高檢測靈敏度。例如在ELISA分析中，IMS的預選擇步驟可以使檢測靈敏度提高近100倍。

4 生物傳感器

在微生物檢測領域，生物傳感器是能夠將生物反應轉化為可觀測信號的分析工具。生物傳感器一般由生物識別元件和換能器兩部分組成。生物識別元件體由固定的生物化合物組成，可識別目標分析物。傳感器將識別樣品轉換為可測量的電信號、光信號或熱信號。有時，一個額外的放大器響應來自傳感器的小信號，并為信號處理器提供更大的輸出信號。用于病原體檢測的生物傳感器根據其使用的生物受體可分為三類，分別是細胞代謝模式、抗體或抗原標志及核酸分析。

抗體傳感器是微生物診斷中最流行的生物傳感器，其原理依賴于上述抗原和抗體之間高度特異性的三維圖像匹配。兩種類型的基于免疫學的生物傳感器，第一種采用固定在電極上的捕獲抗體，來捕獲目標抗原。通過氧化還原分子或酶標記的二抗體來實現信號轉導。第二種利用固定在電極上的抗原來檢測特定的抗體。

酶標記免疫分析方法因其高靈敏度和直接可視化等優點而日益受到人們的重視。事實上，便攜式生物傳感器基于ELISA原理，但更小，更快，更易解釋和更方便。

生物分析傳感器的最新進展利用了某些酶發射光子、生物發光，并伴隨生化反應。三磷酸腺苷（ATP）-生物發光廣泛應用于食品工業，以快速計算加工環境中總細菌的存在并檢測飲用水或飲料中的病原體。該技術基于ATP的存在來測量光強度，一種通過水解ATP來產生光的熒光素酶。光的強度一般與污染程度平行。不僅僅是活細菌，ATP是任何生物物質的基本化合物，因此ATP-生物發光被用作所有生物污染的快速指示器，但不是特異性的，且靈敏度有限。

最近研發的檢測工具是利用核酸雜交的診斷生物傳感器。經典的光學檢測方法使用標記有熒光基團的特性探針。較新的方法是引入用電活性化學物質標記的DNA鏈作為信號分子而不是熒光基團。DNA生物傳感器具有高度靈敏、快速、廉價、穩定、環境不敏感，并且與微陣列技術兼容的特點。

作為病原體檢測的新技術，生物傳感器顯示出現場實時檢測的巨大潛力；然而，需要更好地描述生物傳感器是如何受到食品基質和低細菌數量的影響，以及如何區分死和活細胞。在使用實用工具進行原位分析之前，進一步的研究和開發對于發現細胞活力指標和提高生物傳感器的特異性和敏感性至關重要。