兒童心肌病的基因檢測:我們究竟能從中獲益多少?

(南京醫科大學附屬兒童醫院心內科，江蘇 南京 210019)

心肌病是一類嚴重威脅兒童健康和生命的心臟疾病，根據解剖和病理生理分型，可以分為擴張型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、致心律失常型右心室心肌病(ARVC)和左心室致密化不全(LVNC)等多種類型[1-2]。與成人相比，兒童心肌病在病因和臨床表現等方面更加復雜，除了原發性心肌病外，還需注意遺傳代謝性心肌病，如溶酶體病、線粒體心肌病(神經肌病)等。近年來，隨著現代分子遺傳學技術的發展和應用，心肌病的遺傳學研究取得了巨大進展，并促進了人們對心肌病診治模式理念的更新。目前，開展心肌病的基因檢測、探索心肌病的精準診斷以指導治療和危險分層管理，正逐漸被大家所認識和重視[3-6]。但如何在基因測序后獲得的海量信息中識別出真正的致病突變，正成為我們面臨的新的挑戰，我們究竟能從中獲益多少，值得我們認真思考。

1 兒童心肌病的遺傳基礎

1.1 HCM

HCM約占兒童心肌病的26%～42%，以常染色體顯性遺傳為主，家族性和散發性均有報道，兩者具有相同的遺傳因素。HCM遺傳異質性強，可以存在不完全外顯，但外顯率隨年齡增長而增加。目前發現的HCM致病基因有20多個，其中絕大部分突變位于肌小節蛋白(粗肌絲和細肌絲)基因，因此HCM也被稱作“肌小節病”[7-10]。HCM相關基因主要有：β肌球蛋白重鏈基因(MYH7)和心肌球蛋白結合蛋白C(MYBPC3)基因、編碼粗肌絲蛋白基因[肌球蛋白重鏈基因MYH6、肌球蛋白輕鏈基因(MYL2、MYL3)]、編碼細肌絲蛋白基因[肌動蛋白ACTC、原肌球蛋白TPMl、肌鈣蛋T(TNNT2)、肌鈣蛋白I(TNNI3)、肌鈣蛋白C(TNNCl)]及裝配蛋白基因(肌聯蛋白TTN)。最近有報道在散發性HCM患者中發現了Z蛋白相關基因、鈣離子相關蛋白基因和NEXN基因突變，但在人群中的突變頻率低。

1.2 DCM

與HCM相比，DCM的病因更復雜，診斷原發性DCM，需排除炎癥性心肌病、心動過速性心臟病及各種繼發性因素。DCM有多種遺傳方式，包括常染色體顯性遺傳、染色體隱性遺傳、X連鎖和線粒體遺傳等方式，其中以常染色體顯性遺傳為主。目前發現的DCM致病基因約30多個，包括心肌肌節蛋白基因、Z盤蛋白基因、細胞骨架蛋白基因以及鈣調控蛋白基因[11-13]，主要有LMNA、MYH7、TNNT2、SCN5A、DES、MYBPC3、TNNI3、TPMI、ACTC、PLN、LDB3以及TAZ等基因。近年來的測序發現DCM患者中存在較高頻率的TTN基因突變[14]，但功能研究發現TTN可能發揮了基因修飾的作用。DCM某些特定的表型與特定的基因突變有關，如伴有傳導障礙的DCM多數與核纖蛋白基因(LMNA)或SCN5A基因突變有關[15]；而伴隨骨骼肌病變的DCM通常表現為X連鎖遺傳，多與肌營養不良蛋白(DMD)基因以及TAZ基因的變異有關。相對于HCM，DCM病人中候選基因突變檢出率較低，不少病人存在多個基因的復合雜合突變，也存在不完全外顯，是否與疾病相關還有待研究。

1.3 RCM

與DCM和HCM相比，原發性RCM發病率最低，但進展快、預后差，尤其是兒童RCM，確診后平均生存期僅為2年。筆者診治的10例RCM患兒，大部分死于確診后1年。目前RCM發病機制仍不清楚，散發性RCM和家族性RCM均有報道，提示遺傳因素可能發揮重要作用。近年來，通過對RCM患兒測序發現了較高頻率的肌節蛋白基因(MYH7、TNNT2、TNNI3)突變，此外也發現了DES、TTN基因突變，提示肌節蛋白基因突變可能是RCM的重要遺傳基礎[5,16-19]。DES基因突變導致的RCM，多伴有高度房室傳導阻滯或骨骼肌疾病。

1.4 ARVC

ARVC常以左束支阻滯的室性心動過速為特征，隨著疾病的進展出現心力衰竭。ARVC發病與遺傳關系密切，多呈常染色體顯性遺傳，30%～70%的ARVC患者與橋粒蛋白基因突變有關(如JUP、DSP、PKP2、DSG2及DSC2基因)，少數與非橋粒蛋白(TMEM43和TGFβ3)基因突變有關[3-5,20]，大多數基因具有顯著等位基因異質性。兒童ARVC與成人ARVC具有相同遺傳基礎，但病例報道不多。

1.5 LVNC

LVNC發病機制尚不清楚，近50%的病例有家族史，其遺傳方式多樣化，包括常染色體顯性或者隱形遺傳、X連鎖以及線粒體基因遺傳等。目前發現約有15個基因參與了LVNC的發生，其中包括TAZ、ZASP/LBD3、LMNA以及DTNA等，同時還與MYH7、ACTC、TPM1、MYBPC、TNNT2、FKBP-12以及SCN5A基因的突變有關[3-5]。部分線粒體病，例如BARTH綜合征等可以合并心肌致密化不全。

1.6 遺傳代謝性心肌病

心肌病病兒，尤其嬰兒期起病者，一定要注意遺傳代謝性心肌病可能。此類患兒除心肌病變外，還可伴有血生化異常(肌酸激酶和肝酶升高、低血糖、高血脂、乳酸升高等)，另外還伴有代謝性酸中毒、肝臟腫大、神經肌肉受累等。相對于原發性心肌病，此類患兒通過基因檢測對早期診斷意義重大，因為部分代謝性心肌病經過針對性治療有可能逆轉、阻止或延緩心肌病進展，改善預后[6,21]。

合并心肌肥厚的代謝性疾病主要有糖原累積病Ⅱ型、DANON病、PRKAG2心臟綜合征等。糖原累積病Ⅱ型，又稱POMPE病，常染色體隱性遺傳病，因GAA酶基因突變引起酸性α-1-4葡萄糖苷酶缺乏導致糖原分解障礙，臨床可表現為血清CK明顯增高、肌肉無力、心肌肥厚等，嬰兒期發病多以心肌肥厚為主要表現。DANON病是一種X連鎖顯性遺傳性溶酶體病，由編碼Ⅱ型溶酶體相關膜蛋白(LAMP2)的基因突變導致糖原代謝障礙，臨床表現與DANON病類似，以肥厚型心肌病、骨骼肌病和智力障礙三聯征為主要表現。PRKAG2心臟綜合征為常染色體顯性遺傳，由編碼AMP激活蛋白激酶r-2調節亞單位PRKAG2基因缺陷導致，臨床表現為預激綜合征、進展性傳導系統疾病和心肌肥厚。

對兒童DCM合并血生化異常者，需注意脂肪酸代謝障礙(如肉堿缺乏癥、肉堿棕櫚酰基轉移酶Ⅱ型缺乏癥等)、氨基酸和有機酸代謝障礙(丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、β-酮硫解酶缺乏癥等)、溶酶體病、過氧化物酶體異常等遺傳代謝性疾病；合并神經系統異常(智力發育落后、矮小、驚厥、共濟失調等)，要考慮線粒體病可能。肉堿缺乏癥，是脂肪酸氧化代謝病的常見病種，呈染色體隱性遺傳，由于細胞膜上肉堿轉運體OCTN2缺乏，從而導致肉堿攝取障礙及由尿液中大量流失而引起體內肉堿缺乏，影響脂肪酸代謝，多在2歲以前出現癥狀，臨床表現為低酮性低糖血癥、RYE綜合征、昏迷、DCM、LVNC或者HCM、心律失常等。

法布里病(FABRY病)，為X連鎖隱性遺傳，主要為男性發病，女性雜合子表現輕微或無癥狀，由α-半乳糖苷酶缺乏導致其降解底物三糖苷神經酰胺在溶酶體內大量沉積所致，可表現為發作性肢體疼痛與四肢蟻爬感、皮膚血管角質瘤、腎臟病變，心臟主要表現為RCM或HCM表型。BARTH綜合征是一種主要見于男孩的線粒體疾病，臨床特點為肌無力、生長遲緩、周期性血清中性粒細胞減少和尿中3甲基戊烯二酸增多，心臟受累多表現為DCM或LVNC，也有呈HCM表現。此外，黏多糖病和先天性糖基化病，也可導致HCM或DCM。

2 如何開展兒童臨床心肌病基因檢測

既往多采用候選基因測序法，針對某一特定心肌病表型，檢測1個或幾個相關基因，費時、費力，突變陽性率低。即使基因檢測陰性，也不能排除其他基因變異致病的可能。隨著高通量二代測序技術的出現，人們設計出各種包含上百種心肌病相關基因的芯片，從而可以進行快速檢測。

目前臨床基因檢測已受到社會和臨床醫師的廣泛重視，出現了眾多提供遺傳檢測服務的生物信息公司，少數大的醫療中心可以自行進行測序研究。根據需要，有多種檢測策略可供選擇，如HCM患兒合并肝臟腫大、血清CK升高、外周血白細胞GAA酶活性下降，可以直接選擇單方向疾病檢測方法檢測GAA基因，以進一步確診是否為POMPE病；對大多數心肌病病人，可選擇涵蓋目前已知與遺傳性心肌病相關的所有基因的綜合檢測panel進行檢測；如從科研考慮，可以選擇全外顯子測序，對涵蓋目前人類已知2萬個基因進行檢測；對某些合并神經肌肉病變的心肌病患兒，除進行外顯子組二代測序外，還需考慮拷貝數變異(CNV)和線粒體基因檢測。在先證者發現陽性突變后，進一步對家系成員進行一代測序驗證。

為提高分析能力，盡可能收集先證者家系成員資料，首先對先證者進行二代測序，發現可疑突變后，再進一步對家系成員進行一代測序驗證；也可以直接選擇對先證者核心家系Trio進行二代測序，再驗證其他家族成員，這樣能大大提高突變檢測效率，但費用相對較高。

3 開展兒童心肌病基因檢測的臨床意義及精準診治研究

由于兒童心肌病病因復雜，尤其是HCM和DCM，有時為多系統疾病的一部分，臨床表現隨病程發展而改變，僅依據剛起病時的臨床特征難以診斷，開展臨床診斷相對困難。傳統診斷模式一般根據臨床表現、實驗室檢查作出診斷，但對于部分早期臨床表現不典型、無法確定病因的患兒，可以通過基因檢測實現精準診斷。基因檢測對合并心肌病變的遺傳代謝性疾病的診斷有重要意義，因為此類疾病治療方法與原發性心肌病差異巨大。如FABRY病，是GLA基因突變所致的一種X-連鎖隱性遺傳病，可通過補充α-半乳糖苷酶或轉基因治療。筆者近年來通過基因檢測確診了不少罕見的代謝性心肌病，如POMPE病、DANON病、先天性糖基化病(合并DCM)等，很好地指導了遺傳咨詢；其中對1例有特殊體征的“DCM”患兒通過基因檢測發現IDUA基因突變，確診為黏多糖病Ⅰ型，為IDUA基因突變引起α-L-艾杜糖醛苷酸酶缺乏，骨髓移植是治療該病的主要手段。

目前世界范圍內的研究者們都在利用遺傳技術探索心肌病的精準治療之路，2017年美國心臟協會(AHA)向世界各地的研究者開放了他們的精準醫療平臺。對心肌病致病基因功能研究發現，突變主要是通過改變心肌纖維最大張力、對鈣離子敏感性及能量代謝異常等影響心肌重構。如突變引起心肌細胞對鈣離子敏感性增加、心肌最大張力和心肌收縮力增強，導致舒張功能的障礙，表現為HCM或RCM；相反，如突變引起心肌細胞對鈣離子敏感性減弱、心肌最大張力和心肌收縮力下降，導致收縮功能障礙，表現為DCM。因此，開發高選擇性的心肌球蛋白調節劑以及鈣離子調節劑(增敏劑/減敏劑)有可能成為新的治療手段。2017年8月MyoKardia公司宣布其研制的肌凝蛋白抑制劑mavacamten(MYK461)在PIONEER-HCM的二期臨床試驗顯示能顯著改善HCM舒張功能，證實MYK-461有潛力作為一種重要的新的治療HCM的制劑[22]。

4 大數據下心肌病基因檢測的思考

陳潤生院士認為精準醫學的核心“就是組學大數據和醫學的結合”。二代測序的出現，讓我們從測序技術時代，步入大數據分析時代，但也帶來了新的挑戰。一次基因組檢測可以得到上百萬個突變，但致病突變可能只有一個，如何解決海量數據臨床級別分析成為關鍵。我們在臨床實際應用中發現，遺傳代謝性心肌病陽性檢出率高，易于確診和解釋；而原發性心肌病，突變檢出率相對較低，且存在不同程度的不外顯率，不易解讀[23-24]。

HCM作為典型的遺傳性心血管疾病，并且是單基因心血管疾病中最為常見的疾病，最有可能實現精準醫療。DCM和其他分類心肌病病因復雜，相關基因眾多，不少患者為非肌節蛋白基因突變，有的患者攜帶不止一個相關基因突變，即攜帶了復合突變、雙突變甚至是三突變，數據不易解讀，遺傳診斷困難。攜帶多突變患者預后顯著差于單突變患者。

5 展望

近年來遺傳學技術的進步大大提高了我們識別兒童心肌病潛在病因的能力，但是由于兒童心肌病以散發為主，病因比較復雜，臨床表型異質性強，疾病的進展、治療和預后很難預測。如何對海量的測序信息和臨床信息進行有效分析，成為我們新的挑戰，也是開展精準診治的關鍵。借助大數據技術，建立兒童心肌病的多中心聯合研究，通過隨訪數據與臨床數據、遺傳檢測數據的結合，深度分析兒童心肌病的發病因素及遺傳背景、臨床表型、診斷、用藥、疾病演變及預后之間的關系，探索兒童心肌病的精準診治，建立一套規范合理、易推廣的兒童心肌病的長期管理方案，對提高我國兒童心肌病的診治水平意義重大。