非小細胞肺癌組織Beclin1、LC3表達變化及其臨床意義

張秀義，許浩然，孫亞東

(承德市中心醫院，河北承德067000)

肺癌的發病率和病死率均居惡性腫瘤前三位，已成為嚴重威脅人類健康的公共衛生問題之一。絕大多數肺癌患者確診時已屬晚期，預后極差。有研究發現，細胞周期控制基因突變導致正常細胞增殖調節失控及機體抗凋亡功能異常亢進是腫瘤形成的重要原因。細胞自噬是將細胞內折疊錯誤、老化的蛋白質及受損后失去作用的細胞器在溶酶體內降解的過程[1]。自噬作為一種細胞內大分子物質的降解通路，是真核細胞所特有的代謝途徑。當腫瘤細胞增殖過度活躍時，會促進腫瘤細胞自噬性凋亡，抑制腫瘤生長。機體內存在多種自噬調控基因，其功能異常引起的細胞自噬活性改變與腫瘤發生、發展密切相關。自噬相關蛋白Beclin1主要誘導自噬的啟動，是自噬中最重要的正向調節因子。微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)是惟一定位于自噬泡內膜的自噬相關蛋白，主要作用是促進自噬小體的成熟，其表達變化可反映細胞自噬活性。本研究觀察了非小細胞肺癌(NSCLC)組織Beclin1、LC3表達變化，并分析二者表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系，旨在探討細胞自噬在NSCLC發生、發展病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月～2018年3月在承德市中心醫院行外科手術治療的NSCLC患者96例，術前均未行任何抗腫瘤治療。其中，男62例、女34例，年齡48～75(61.4±8.34)歲；組織學類型：腺癌46例，鱗癌50例；組織分化程度：高分化38例，低中分化58例；有淋巴結轉移40例，無淋巴結轉移56例。對照標本取自NSCLC組織遠端正常支氣管及肺泡組織(距腫瘤邊緣3～5 cm)，其中支氣管組織60例份、肺泡組織64例份。本研究經承德市中心醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 Beclin1、LC3表達檢測 采用免疫組化SP法。將組織標本用4%甲醛固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋后，4 μm厚切片，烤干后保存。經環保透明劑脫蠟、梯度乙醇脫水后，加入檸檬酸緩沖液修復。正常山羊血清工作液封閉，然后加入一抗(Beclin1、LC3)，4 ℃孵育過夜。次日加入生物素化二抗工作液及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用已知Beclin1、LC3陽性的組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。采用雙盲法由兩名資深病理科醫師獨立閱片，結果不一致時，由第三名病理科醫師最終判定。每張切片隨機選取10個高倍視野，每視野觀察100個細胞，Beclin1、LC3陽性染色均定位于細胞質，呈棕黃色或褐色細顆粒狀。根據陽性細胞所占比例及染色強度綜合判定陽性表達。陽性細胞所占比例評分：≤5%為0分，﹥5%～25%為1分，﹥25%～50%為2分，>50%為3分；染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項得分相加≤3分為陰性表達，>3分為陽性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料以百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織Beclin1、LC3表達比較 Beclin1在NSCLC及正常肺泡、支氣管組織中的陽性表達率分別為31.25%(30/96)、75.0%(48/64)、66.67%(40/60)。NSCLC組織Beclin1陽性表達率明顯低于正常肺泡、支氣管組織(χ2分別為29.418、18.723，P均<0.01)，而正常肺泡與支氣管組織比較差異無統計學意義(χ2=1.044，P﹥0.05)。LC3在NSCLC及正常肺泡、支氣管組織中的陽性表達率分別為26.04%(25/96)、81.25%(52/64)、80.0%(48/60)。NSCLC組織LC3陽性表達率明顯低于正常肺泡、支氣管組織(χ2分別為46.883、43.178，P均<0.01)，而正常肺泡與支氣管組織比較差異無統計學意義(χ2=0.031，P﹥0.05)。

2.2 不同臨床病理特征NSCLC患者腫瘤組織Beclin1、LC3陽性表達比較 腫瘤直徑>3 cm、組織分化程度低中分化、有淋巴結轉移者NSCLC組織Beclin1陽性表達率較腫瘤直徑≤3 cm、組織分化程度高分化、無淋巴結轉移者明顯降低(P<0.05或<0.01)；組織分化程度低中分化、有淋巴結轉移者NSCLC組織LC3陽性表達率較組織分化程度高分化、無淋巴結轉移者明顯降低(P均<0.01)。見表1。

表1 不同臨床病理特征NSCLC患者癌組織Beclin1、LC3陽性表達比較

2.3 NSCLC組織Beclin1陽性表達與LC3陽性表達的關系 NSCLC組織Beclin1陽性表達與LC3陽性表達呈正相關關系(r=0.419，P<0.05)。

3 討論

細胞自噬是細胞器和大分子物質在自噬體中降解的過程，通過降解細胞內衰老或因外界環境壓力導致破損的細胞器、老化的蛋白質以及合成或折疊錯誤的蛋白質，從而實現細胞的自我修復和蛋白質的循環利用，加強細胞檢查糾錯作用，穩定細胞基因組，保持細胞自穩狀態。自噬活性長期受到抑制，有害因素在細胞內持續積累，可導致腫瘤形成。人類絕大多數腫瘤中存在細胞自噬功能異常。惡性腫瘤組織營養需求旺盛，自噬可為腫瘤細胞提供營養，此時提高自噬活性有助于度過營養危機。放化療后大量異常蛋白質及破損細胞器生成，自噬及時清除這些物質，可減輕有害物質對腫瘤細胞的損傷。研究顯示，在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等細胞中存在自噬正向調節因子缺失[2～4]；細胞自噬被抑制后，在乳腺癌、結腸癌及睪丸癌等均觀察到由環境壓力導致的細胞凋亡增多。因此，細胞自噬在腫瘤發生、發展中具有雙重作用，一方面細胞自噬能穩定細胞內環境使腫瘤細胞耐受缺氧環境，維持細胞存活；另一方面，當細胞自噬過度亢進，可誘導腫瘤細胞死亡，抑制腫瘤細胞增殖。

Beclin1基因是哺乳動物細胞中惟一特異性自噬基因，其編碼蛋白與磷酯酰肌醇3激酶家族Ⅲ形成自噬體，介導其他自噬蛋白定位于吞噬泡，在自噬體的形成及成熟過程中發揮重要作用，是重要的抑癌基因。研究證實，Beclin1基因缺失及蛋白表達降低與腫瘤發生顯著相關。小鼠細胞Beclin1的等位基因被敲除后，肺癌、肝癌、淋巴癌的發生率明顯升高[5]，Beclin1+/-突變小鼠較野生型小鼠更易于誘發腫瘤。在人類腫瘤細胞中，Beclin1蛋白與PI3K形成復合體，可調節Atg蛋白在吞噬泡結構中的定位；其過表達能促進自噬小體成熟，誘導腫瘤細胞自噬活性增加[6]。有研究顯示，卵巢癌、乳腺癌、乳腺導管癌及宮頸癌組織中Beclin1蛋白及mRNA表達明顯降低[7～9]，原發性肝細胞癌組織Beclin1蛋白表達明顯高于正常肝組織[10，11]，結直腸癌和胃癌組織中Beclin1過表達。目前認為，不同類型腫瘤組織中的表達差異可能與Beclin1對細胞自噬調控的雙重性有關。消化系統腫瘤Beclin1高表達通過加強自噬活性，減輕腫瘤增殖過程中缺血、缺氧及有害物質對腫瘤細胞的殺傷作用，從而發揮腫瘤保護作用。本研究結果顯示，Beclin1在NSCLC組織中的陽性表達率明顯低于正常肺組織，提示在肺癌組織中Beclin1基因轉錄減少及其蛋白表達缺失，自噬活性明顯降低，自噬體形成減少，腫瘤細胞自噬功能下降、凋亡不足，導致異常細胞持續增加，最終形成腫瘤。進一步分析顯示，腫瘤直徑>3 cm、組織分化程度低中分化、有淋巴結轉移者NSCLC組織Beclin1陽性表達度較腫瘤直徑≤3 cm、組織分化程度高分化、無淋巴結轉移者明顯降低，提示Beclin1在NSCLC早期表達活躍。其表達隨腫瘤組織分化程度降低而逐漸下降，考慮為Beclin1基因低表達及蛋白缺失可使有缺陷的細胞凋亡減少，細胞生長呈現無節制、不受控狀態。Beclin1表達越少，組織分化程度越低，腫瘤惡性傾向越明顯。腫瘤晚期Beclin1完全失活，逐漸喪失其抑癌功能，更具侵襲性和轉移能力，故患者預后較差。

LC3是惟一定位于自噬泡內膜的自噬調節蛋白。當細胞自噬啟動后，LC3前體首先加工成LC3-Ⅰ并溶于細胞質內，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結合生成LC3-Ⅱ。只有與PE結合狀態的的LC3-Ⅱ定位于自噬泡膜上，才能發揮調節功能，故LC3-Ⅱ蛋白表達與自噬泡數量呈正相關關系，可直接反映細胞自噬活性[12]。胃癌、結直腸癌及宮頸癌等組織中LC3異常表達[13]。Wu等[14]報道，LC3在中低分化結直腸癌組織中的表達明顯低于高分化結直腸癌組織，在伴淋巴結轉移的結直腸癌組織中的表達高于無淋巴結轉移的結直腸癌組織。本研究結果顯示，NSCLC組織LC3陽性表達率明顯低于正常組織，組織分化程度低中分化、有淋巴結轉移者NSCLC組織LC3陽性表達率較組織分化程度高分化、無淋巴結轉移者明顯降低。提示在NSCLC中細胞自噬活性下調，隨著組織分化程度下降及淋巴結轉移，其表達逐漸降低，推測LC3低表達可能與NSCLC發生、發展有關。在NSCLC發生、發展過程中，LC3表達下調使自噬體生成減少，自噬活性降低，增加了腫瘤易感性，促進了腫瘤進展。

本研究發現，NSCLC組織Beclin1陽性表達與LC3陽性表達呈正相關關系。推測兩者作為細胞自噬調節通路的上下游靶點，具有協同促癌作用；其同步低表達可導致細胞自噬能力降低、內環境自穩能力障礙，可導致NSCLC的發生、發展。NSCLC形成以后，Beclin1作為抑癌基因激活細胞自噬，LC3加快自噬小體成熟速度，二者共同促進細胞自噬活性增加，導致腫瘤細胞程序性死亡，從而產生抑癌作用；腫瘤細胞增殖失控導致其長期處于缺血、缺氧狀態，細胞內有毒有害物質大量堆積，刺激腫瘤細胞的自噬活性持續升高，最終導致腫瘤細胞發生自噬性死亡。

綜上所述，NSCLC組織自噬相關蛋白Beclin1、LC3表達降低，細胞自噬對NSCLC的發生、發展可能具有抑制作用。