炎癥性腸病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)變化及其與病情的關(guān)系

郭艷，王云溪，高琦，魏小娟

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000)

炎癥性腸病(IBD)作為消化系統(tǒng)常見的非特異性炎癥性病變，主要包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。IBD的病因和發(fā)病機(jī)制不明，以腹痛、腹瀉、腸梗阻、腸穿孔等為主要臨床表現(xiàn)，被認(rèn)為是結(jié)直腸癌的癌前病變[2]。在對(duì)IBD進(jìn)行臨床診斷及病情評(píng)估時(shí)，常在排除感染及其他非感染性結(jié)腸炎基礎(chǔ)上，根據(jù)臨床癥狀及消化道內(nèi)窺鏡檢查、病理檢查結(jié)果綜合判定。上述檢查不僅操作復(fù)雜、費(fèi)用高，而且為侵入性檢查，部分患者耐受性差[3]。因此，積極尋找一種方便、經(jīng)濟(jì)、可靠的方法用于IBD診斷及病情評(píng)估已成為臨床研究的重點(diǎn)。研究表明，黏膜免疫功能紊亂與IBD密切相關(guān)[4]。微小RNA-146a(miR-146a)作為一種高度保守的短鏈非編碼RNA，在與靶基因結(jié)合后，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，與炎癥反應(yīng)及免疫穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[5]，在多種炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[6]。本研究觀察了IBD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)變化，并探討其與炎癥活動(dòng)度的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月～2017年10月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院就診的IBD患者137例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2012年，廣州)》[7]中IBD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②就診前30天未使用過糖皮質(zhì)激素、水楊酸抑制劑、免疫抑制劑。排除急慢性感染者、自身免疫系統(tǒng)疾病者、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者以及肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者。其中，男73例、女64例，年齡19～65(40.8±9.3)歲；BMI(21.6±1.5)kg/m2。UC患者63例(UC組)，男29例、女34例，年齡19～64(42.0±9.8)歲，BMI(21.6±1.7)kg/m2，病程(38.3±12.5)個(gè)月，病變部位:右半結(jié)腸28例、左半結(jié)腸35例；CD患者74例(CD組)，男44例、女30例，年齡20～65(39.8±8.8)歲，BMI(21.5±1.4)kg/m2，病程(30.8±15.4)個(gè)月，病變部位:右半結(jié)腸45例、左半結(jié)腸29例。UC組與CD組臨床資料具有可比性。另選取疑似IBD而經(jīng)臨床檢查排除的健康者50例作為對(duì)照組，男29例、女21例，年齡(39.6±9.1)歲，BMI(21.3±1.3)kg/m2。UC組、CD組和對(duì)照組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情同意。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及miR-146a表達(dá)檢測(cè) 留取三組晨起空腹肘靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管內(nèi)，300 g離心，留取血漿，用等體積PBS稀釋，加入人淋巴細(xì)胞分離液，160 g離心15 min，留取白細(xì)胞層，加入5倍體積PBS，160 g離心10 min，留取沉淀，即為外周血單個(gè)核細(xì)胞，- 80 ℃冰箱保存。取外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，按照TRIzol總RNA提取試劑盒說明提取總RNA，采用核酸凝膠圖像分析儀進(jìn)行電泳分析，用分光光度計(jì)檢測(cè)純度，以A260/A280為1.80～2.20，表明提取的總RNA合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上按照PCR擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-146a上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATA-3′，下游引物5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，92 ℃ 30 s、92 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、75 ℃ 30 s共循環(huán)38次。每樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a相對(duì)表達(dá)量。

1.3 C-反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)檢測(cè)及疾病活動(dòng)度、內(nèi)鏡下病變嚴(yán)重程度評(píng)估 采用ELISA法檢測(cè)血清CRP，采用自動(dòng)血沉測(cè)定儀檢測(cè)ESR。根據(jù)改良Mayo評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]評(píng)估UC患者活動(dòng)度，其中緩解10例、輕度活動(dòng)19例、中度活動(dòng)22例、重度活動(dòng)12例；根據(jù)CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI)[8]評(píng)估CD患者活動(dòng)度，其中緩解14例、輕度活動(dòng)17例、中度活動(dòng)24例、重度活動(dòng)19例。采用修正Baron評(píng)分系統(tǒng)[9]和CD內(nèi)鏡嚴(yán)重程度指數(shù)(CDEIS)[9]分別評(píng)估UC、CD患者內(nèi)鏡下病變嚴(yán)重程度。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)比較 IBD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量為1.80±0.17，其中UC組、CD組分別為1.76±0.16、1.97±0.23，對(duì)照組為1.04±0.10。IBD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，且CD組高于UC組(P均<0.05)。UC組和CD組活動(dòng)期外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于緩解期，輕度活動(dòng)者、中度活動(dòng)者、重度活動(dòng)者miR-146a相對(duì)表達(dá)量依次升高(P均<0.05)。見表1。

表1 UC組與CD組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)比較

注：與同組緩解期比較，aP<0.05；與同組輕度活動(dòng)者比較，bP<0.05；與同組中度活動(dòng)者比較，cP<0.05。

2.2 IBD患者miR-146a表達(dá)與CRP、ESR、疾病活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性 UC組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量與CRP、ESR、Mayo評(píng)分和修正Baron評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.297、0.338、0.661、0.548，P均<0.05)；CD組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量與CRP、ESR、CDAI、CDEIS均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.351、0.427、0.772、0.614，P均<0.05)。

2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)對(duì)IBD疾病活動(dòng)度的預(yù)測(cè)價(jià)值 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)預(yù)測(cè)UC患者中重度活動(dòng)度的ROC曲線下面積為0.884(95%CI：0.781～0.987)，其cut off值為1.64，此時(shí)其預(yù)測(cè)UC患者中重度活動(dòng)度的敏感性為86.8%、特異性為80.0%。外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)預(yù)測(cè)CD患者中重度活動(dòng)度的ROC曲線下面積為0.980(95%CI：0.955～1.000)，其cut off值為1.77，此時(shí)其預(yù)測(cè)CD患者中重度活動(dòng)度的敏感性為91.7%、特異性為100.0%。見圖1、2。

圖1 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)對(duì)UC患者中重度活動(dòng)度的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖2 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)對(duì)CD患者中重度活動(dòng)度的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

IBD作為一種慢性腸道炎癥性疾病，緩解期和活動(dòng)期交替反復(fù)，病情遷延難愈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[10]。IBD病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為與環(huán)境、基因、免疫等因素有關(guān)[11]。目前，臨床上診斷及評(píng)估IBD疾病活動(dòng)度主要依靠?jī)?nèi)鏡活檢，但內(nèi)鏡活檢具有創(chuàng)傷性，且不能動(dòng)態(tài)觀察患者病情。CRP和ESR是臨床常用監(jiān)測(cè)IBD的生物學(xué)指標(biāo)，但敏感性和特異性較低，且易受機(jī)體其他因素或疾病的影響[12]。因此，亟需尋找一種可用于監(jiān)測(cè)IBD活動(dòng)度的敏感指標(biāo)，以指導(dǎo)臨床治療。

近年研究認(rèn)為，IBD是一種自身免疫性疾病，腸道黏膜免疫功能異常與IBD發(fā)病密切相關(guān)[13]。miRNA作為一種高度保守的非編碼短鏈RNA，在免疫炎癥反應(yīng)[14]、自身免疫性疾病[15]等的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。miR-146a是miRNA的重要類型，已被證實(shí)可參與自身免疫性疾病的發(fā)生過程[16]。本研究結(jié)果顯示，IBD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示miR-146a可能參與IBD的發(fā)病過程。

UC和CD是IBD的主要疾病類型，患者臨床癥狀相似，但治療手段及并發(fā)癥不盡相同[17]，且二者基因譜表達(dá)及細(xì)胞表現(xiàn)差異明顯[18]。本研究結(jié)果顯示，CD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于UC患者，說明miR-146a表達(dá)在CD患者和UC患者中存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析原因，可能與CD病變可累及整個(gè)消化道及病理改變較重有關(guān)[19]。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，UC患者miR-146a相對(duì)表達(dá)量與CRP、ESR、改良Mayo評(píng)分和修正Baron評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系，CD患者miR-146a相對(duì)表達(dá)量與CRP、ESR、CDAI和CDEIS均呈正相關(guān)關(guān)系，說明無論是UC還是CD，外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)均與患者疾病活動(dòng)度有關(guān)。ROC曲線分析顯示，miR-146a表達(dá)預(yù)測(cè)UC患者中重度活動(dòng)度的曲線下面積為0.884(95%CI：0.781～0.987)，其cut off值為1.64，此時(shí)其預(yù)測(cè)UC患者中重度活動(dòng)度的敏感性為86.8%、特異性為80.0%；miR-146a表達(dá)預(yù)測(cè)CD患者中重度活動(dòng)度的曲線下面積為0.980(95%CI：0.955～1.000)，其cut off值為1.77，此時(shí)其預(yù)測(cè)CD患者中重度活動(dòng)度的敏感性為91.7%、特異性為100.0%。上述結(jié)果說明，miR-146a可作為預(yù)測(cè)UC和CD活動(dòng)度的指標(biāo)，當(dāng)UC、CD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到1.64、1.77時(shí)，高度懷疑患者處于疾病活動(dòng)期。

綜上所述，IBD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a高表達(dá)，且CD患者miR-146a表達(dá)高于UC患者；miR-146a表達(dá)與IBD疾病活動(dòng)度和病變嚴(yán)重程度有關(guān)，有望成為評(píng)估IBD疾病活動(dòng)度的指標(biāo)。但本研究樣本量較少且為單中心研究，其結(jié)論準(zhǔn)確性尚需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量、開展多中心研究加以驗(yàn)證。