生脈散對2型糖尿病大鼠胰島β細胞NF-κB/IκB及VEGF表達的影響

吳小慧，劉菲，段忠心

(南華大學附屬第二醫院，湖南衡陽421001)

2型糖尿病(T2DM)發生、發展的始動因素是胰島素抵抗[1]，而胰島素抵抗還是一個慢性亞臨床炎癥反應過程[2]。NF-κB/IκB信號通路是炎癥導致胰島素抵抗和胰島β細胞功能減退以及動脈粥樣硬化的重要途徑之一[3]。中醫認為，糖尿病的發病機制主要為陰津虧損、燥熱偏盛。生脈散是益氣養陰的基礎方，臨床常用于治療糖尿病，但目前對其作用機制尚不清楚。2015年3～12月,本研究觀察了生脈散對T2DM大鼠胰島素抵抗、胰島β細胞NF-κB/IκB表達及血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響，旨在探討生脈散治療T2DM的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠120只，清潔級，8周齡，體質量180～225 g，購自南華大學實驗動物學部，動物許可證號：SYXK(湘)2015-0001。本研究經南華大學動物倫理委員會批準。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 生脈散組方：人參9 g、麥門冬9 g、五味子6 g，購自湖南三湘中藥飲片有限公司，經加工研制成湯劑，由南華大學附屬第二醫院中藥房提供；SYBRGreen qPCR試劑盒(上海達為科生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，阿司匹林腸溶片(湖南新匯制藥股份有限公司)；PCR儀器(美國ABI公司)，離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，血糖儀(長沙三諾生物傳感股份有限公司)。

1.3 動物分組、模型制備及藥物干預 將120只SD大鼠隨機分為A組20只和造模組100只。A組予以基礎飼料喂養。造模組基礎飼料適應性喂養1周，給予高脂飼料(碳水化合物熱卡占20%，脂肪熱卡占61%，蛋白質熱卡占19%，脂肪成分主要為熟豬油)喂養8周，一次性腹腔注射0.25%鏈脲佐菌素30 mg/kg(用pH 4.4的0.1 mol/L無菌枸櫞酸緩沖液配制)。注射72 h測血糖>16.7 mmol/L，表明造模成功。造模組建模成功70只，隨機分為B、C、D、E、F組，每組14只。B組給予等量生理鹽水灌胃，C組給予0.2 g/(kg·d)阿司匹林灌胃，D、E、F組給予4.7、9.4、18.8 g/(kg·d)生脈散湯劑灌胃，持續治療4周。實驗期間，A、B、C、D、E、F組分別死亡6、3、1、2、1、3只。

1.4 空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)檢測及胰島素敏感性指數(ISI)、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)計算 治療前及治療4周，大鼠進食12 h，尾靜脈取血約5 mL，離心留取血清，-20 ℃冰箱保存。分別采用血糖儀和ELISA法檢測FPG、FINS，計算ISI、HOMA-IR。ISI=1/FBG×FINS，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.5 血清VEGF檢測 大鼠麻醉后球后取血5 mL，按ELISA試劑盒說明書進行加樣，封膜板蓋住反應板，恒溫箱溫育約60 min，洗滌后加入顯色劑，恒溫避光顯色12 min，加入終止液，10 min后采用酶標儀依序測量各孔的吸光度。根據標準品曲線，計算血清VEGF水平。

1.6 主動脈血管結構觀察 大鼠麻醉后，迅速取出主動脈組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續冠狀切片。切片分別予二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木素-伊紅染色、乙醇復脫、二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.7 胰腺組織NF-κB、IκB mRNA檢測 大鼠麻醉后，迅速取出胰腺組織，- 80 ℃保存，按照試劑盒和逆轉轉錄試劑盒說明書進行RNA提取和cDNA制備，然后進行PCR擴增。NF-κB上游引物：5′-AGTTGGAGCAGCTGCAGCGC-3′，下游引物：5′-GGAGGGCTCCGCTGGTT-3′；IκB上游引物：5′-GCAACCCAGTGGTGGCCCAG-3′，下游引物：5′-CTCCCGCTGGCTGACCTGGA-3′；β-action上游引物：5′-AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，下游引物：5′-TGGATACATTGGGGGTAGGA-3′。經吸光度掃描儀掃描，PCR條帶用軟件進行定量分析，基因表達量用β-action內參進行標準化。

2 結果

2.1 各組治療前后FPG、FINS比較 見表1。

表1 各組治療前后FPG、FINS比較

注：與同組治療前比較，aP<0.05；與B組治療同期比較，bP<0.05；與C組治療同期比較，cP<0.05。

2.2 各組治療前后ISI、HOMA-IR比較 見表2。

2.3 各組治療前后血清VEGF水平比較 A、B、C、

表2 各組治療前后ISI、HOMA-IR比較

注：與同組治療前比較，aP<0.05；與B組治療同期比較，bP<0.05；與C組治療同期比較，cP<0.05。

D、E、F組血清VEGF水平分別為(211.430±11.359)、(273.910±4.527)、(258.690±4.423)、(262.170±5.149)、(247.080±4.907)、(245.450±3.532)pg/mL。與A組比較，B、C、D、E、F組血清VEGF水平均明顯升高(P均<0.05)；與B組比較，C、D、F組血清VEGF水平均明顯降低(P均<0.05)；與C組比較，E、F組血清VEGF水平均明顯降低(P均<0.05)。

2.4 各組主動脈血管結構比較 A組血管內側壁平整光滑，平滑肌細胞排列整齊；與A組比較，B組血管內側壁內膜粗糙，平滑肌細胞排列紊亂；與B組比較，C、D、E、F組血管內側壁內膜稍粗糙，平滑肌細胞排列不規則，E、F組血管壁結構損傷較C、D組有所緩解。

2.5 各組胰島β細胞NF-κB、IκB mRNA表達比較 見表3。

表3 各組胰島β細胞NF-κB、IκB mRNA相對表達量比較

注：與B組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05。

3 討論

目前，國內糖尿病患者數量超過1億，其中T2DM約占90%[4]。在T2DM患者中，胰島素抵抗的發生率超過80%[5]，胰島素抵抗與NF-κB信號轉導通路關系密切。糖尿病狀態下，高血糖、高血脂及胰島素抵抗等病理機制誘發的炎癥反應，是導致糖尿病冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發生、發展的重要原因[6]，通過降低炎癥反應、改善胰島素抵抗、控制血糖水平是防治糖尿病性冠心病的重要途徑。

糖尿病在中醫學中屬于“消渴”范疇，主要病機為陰虛為本、燥熱為標。生脈散出自《醫學啟源》一書，方中人參甘溫，有益元氣，具有生津液、補肺氣的作用，用以為君；麥門冬甘寒，具有潤肺生津、養陰清熱的作用，是為臣藥；人參與麥門冬合用，更彰顯益氣養陰之效；五味子酸溫，有斂肺止汗、生津止渴之功，為佐藥；三藥合用，一補一潤一斂， 益氣養陰，氣充脈復，為益氣養陰的基礎方，臨床上常用于治療糖尿病[7,8]。但目前對其作用機制尚不清楚。

NF-κB是一個具有多向轉錄激活功能的調節因子，是炎癥介導胰島素抵抗和胰島β細胞功能減退的重要途徑，屬于炎癥反應過程的關鍵調控因子，主要通過氧化應激引起炎癥反應，繼而導致糖尿病及其并發癥的發生[3]。IκB位于細胞質內，主要在非激活狀態下通過攔截NF-κB的核定位序列阻止NF-κB的核定位，抑制其激活，IκB受IκK的調節，使其絲氨酸殘基磷酸化[9]，誘導IκB快速分解，充分暴露NF-κB的核定位序列，激活后迅速移位，與κB的位點結合，調節靶基因轉錄，參與炎癥反應和細胞分化，引起胰島素抵抗和胰島β細胞功能減退。同時，NF-κB還能誘導外周血單個核細胞，使單核細胞向動脈內膜遷移形成泡沫細胞，加速動脈粥樣硬化，引起糖尿病相關并發癥[10]。VEGF能夠增加血管通透性，對單核細胞和巨細胞有化學趨化作用，是糖尿病血管病變的高危因子[11,12]，可引起血管壁結構改變，加速動脈粥樣硬化形成。

本研究結果顯示，E、F組能顯著降低FBS、FINS和HOMA-IR，升高ISI，降低血清VEGF水平，改善血管壁結構，降低NF-κB mRNA，提高IκB mRNA表達，效果優于C組；而D組上述效果與C組比較無明顯統計學差異，說明精確的劑量控制才能使生脈散發揮最佳的治療效果。

總之，生脈散能夠明顯改善T2DM大鼠胰島素抵抗，降低血清VEGF水平，改善血管壁結構，其作用機制可能是通過抑制NF-κB/IκB表達實現的。