Cdk5抑制劑Roscovitine對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛行為學(xué)的影響及機(jī)制

鐘妤，陳佳林，謝玉波，陳靜

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能紊亂引起的疼痛，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但其發(fā)病機(jī)制不明，目前缺乏有效的治療措施。因此，探討神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的治療藥物具有重要意義。近年研究表明，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病的重要原因[1,2]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物。細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(Cdk5)屬于細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶家族，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓水平Cdk5參與介導(dǎo)慢性疼痛長(zhǎng)時(shí)程的傷害性行為，是疼痛異常調(diào)節(jié)的一個(gè)新靶點(diǎn)[3]。有研究表明，應(yīng)用Cdk5拮抗劑Roscovitine可有效緩解疼痛[4,5]，但其是否通過參與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而減輕神經(jīng)病理性疼痛尚不清楚。2017年11月～2018年7月，我們采用Roscovitine鞘內(nèi)注射干預(yù)神經(jīng)病理性疼痛大鼠，觀察其對(duì)大鼠痛行為學(xué)及脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，旨在探討Cdk5在神經(jīng)病理性疼痛中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 成年雄性SPF級(jí)SD大鼠64只，體質(zhì)量200～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，室溫飼養(yǎng)，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Cdk5抑制劑Roscovitine(美國Targetmol公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，GFAP抗體、GAPDH抗體、HRP二抗(美國CST公司)，von Frey纖維絲(美國Stoelting公司)，ME410C型全自動(dòng)熱輻射刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，5-0可吸收鉻腸線(上海醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組)8只、假手術(shù)組(S組)8只、坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)組(I組)8只、CCI+溶劑組(D組)8只，其余32只作為CCI+給藥組(R組)。

1.3 鞘內(nèi)置管方法 為避免鞘內(nèi)置管操作對(duì)大鼠痛行為學(xué)的影響，在行CCI造模前7天，按文獻(xiàn)[6]方法對(duì)各組鞘內(nèi)置管。大鼠麻醉后俯臥于手術(shù)臺(tái)上，腰部備皮，在L5～L6間隙作長(zhǎng)約1 cm的縱切口，切開筋膜，顯示L5和L6棘突間隙，用25G針穿破黃韌帶及硬脊膜，可見清亮的腦脊液外溢，經(jīng)硬脊膜破口處插入PE-10導(dǎo)管約2 cm，導(dǎo)管經(jīng)皮下隧道于頸部引出，外露2 cm固定，術(shù)畢立即腹腔注射青霉素20萬單位，并單籠飼養(yǎng)。大鼠清醒后若出現(xiàn)雙側(cè)下肢癱瘓，表明脊髓損傷，排除本實(shí)驗(yàn)；術(shù)后3天經(jīng)PE-10導(dǎo)管注入2%鹽酸利多卡因5 μL、生理鹽水10 μL沖管，約10 s大鼠可出現(xiàn)雙下肢癱軟，并于30 min左右恢復(fù)，即鞘內(nèi)置管成功。

1.4 神經(jīng)病理性疼痛模型制備 I組、D組和R組鞘內(nèi)置管7天后，采用CCI法建立神經(jīng)病理性疼痛模型[5]：腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，切開右大腿后側(cè)中部，暴露坐骨神經(jīng)主干，于坐骨神經(jīng)分叉處以上用5-0可吸收鉻腸線結(jié)扎4道，間隔1 mm，結(jié)扎時(shí)以肢體輕微抽動(dòng)為度。造模后以出現(xiàn)明確的抬足和舔足等行為，術(shù)后第7天機(jī)械性縮足閾值(PWMT)、熱縮足潛伏期(PWTL)明顯下降，表明大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型制備成功。S組暴露坐骨神經(jīng)但不予結(jié)扎，N組不做任何處理。

1.5 干預(yù)方法 D組和R組分別于術(shù)后第7天鞘內(nèi)注射5%DMSO 20 μL和Cdk5抑制劑Roscovitine 100 μg(溶于20 μL 5% DMSO中)，然后均注入5 μL生理鹽水沖洗導(dǎo)管，以保證藥品全部注入蛛網(wǎng)膜下腔。N組、S組、I組均不注射藥物。

1.6 痛行為學(xué)指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 PWMT測(cè)定 按照文獻(xiàn)[4]方法，分別于術(shù)前(T0)、術(shù)后3天(T1)、術(shù)后5天(T2)、術(shù)后7天(T3)以及給藥后0.5(T4)、2(T5)、6(T6)、12 h(T7)檢測(cè)PWMT。將大鼠置于金屬篩網(wǎng)上，用10 cm×10 cm×15 cm的透明有機(jī)玻璃箱罩住，適應(yīng)15 min后，采用標(biāo)準(zhǔn)化von Frey纖維絲垂直刺激術(shù)側(cè)后足中部，持續(xù)時(shí)間≤4 s，刺激力度從2.0 g開始，以出現(xiàn)抬足或舔足為陽性反應(yīng)，若不能引出陽性反應(yīng)，給予相鄰大一級(jí)力度刺激，直至找到出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最小刺激力度。以此力度刺激5次，間隔30 s，以出現(xiàn)3次或以上陽性反應(yīng)時(shí)的刺激力度為PWMT；若刺激力度超過15.0 g或低于1.0 g，則直接記為15.0 g或1.0 g。

1.6.2 PWTL測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]方法，分別于T0～T7時(shí)檢測(cè)PWTL。將大鼠置于底部為3 mm厚玻璃板的10 cm×10 cm×15 cm透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，用ME410C型全自動(dòng)熱輻射刺激儀照射大鼠術(shù)側(cè)后足中部，從開始照射至術(shù)側(cè)后肢出現(xiàn)特征性甩動(dòng)、抬足或舔足時(shí)的時(shí)間為PWTL，最長(zhǎng)照射時(shí)間為25 s。每次測(cè)定間隔5 min，連續(xù)測(cè)定3次，取其平均值作為PWTL。

1.7 脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞膠GFAP表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。R組于給藥T4～T7時(shí)痛行為學(xué)檢測(cè)后各取8只取材；N組、S組、I組于術(shù)后7天取材，D組于術(shù)后7天鞘內(nèi)注射后取材。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉深麻醉后，于冰臺(tái)迅速取脊髓腰膨大處(L4～L6)，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑研磨勻漿，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。取等量蛋白樣本加入上樣緩沖液，在沸水浴5 min充分變性。加樣至10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，濕電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入一抗GFAP抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌，加入HRP二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。采用ECL掃膜儀進(jìn)行掃膜。利用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以GFAP電泳條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH電泳條帶灰度值的比值作為反映GFAP相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間PWMT比較 與T0比較，I組、D組和R組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PWMT均明顯降低(P均<0.05)；與N組、S組比較，I組、D組和R組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PWMT均明顯降低(P均<0.05)；與I組比較，R組T5～T7時(shí)PWMT均明顯升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)PWMT比較

注：與本組T0時(shí)比較，*P<0.05；與N組、S組比較，﹟P<0.05；與I組比較，△P<0.05。

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)PWTL比較 與T0時(shí)比較，I組、D組和R組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PWMT均明顯降低(P均<0.05)；與N組、S組比較，I組、D組和R組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PWTL均明顯降低(P均<0.05)；與I組比較，R組T5～T7時(shí)PWTL均明顯升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)PWTL比較

注：與本組T0時(shí)比較，*P<0.05；與N組、S組比較，﹟P<0.05；與I組比較，△P<0.05。

2.3 各組脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)比較 N組、S組、I組、D組GFAP相對(duì)表達(dá)量分別為0.44±0.03、0.47±0.02、1.30±0.04、1.31±0.02，R組T4～T7時(shí)GFAP相對(duì)表達(dá)量分別為1.23±0.09、0.79±0.07、0.68±0.02、0.82±0.34。與S組比較，I組、D組和R組T4～T7時(shí)脊髓GFAP相對(duì)表達(dá)量均明顯上調(diào)(P均<0.05)，N組脊髓GFAP相對(duì)表達(dá)量變化不明顯(P>0.05)；與I組比較，R組T5～T7時(shí)脊髓GFAP相對(duì)表達(dá)量均明顯下調(diào)(P均<0.05)，D組脊髓GFAP相對(duì)表達(dá)量變化不明顯(P>0.05)。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是機(jī)體由于周圍神經(jīng)系統(tǒng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷造成的一種慢性病理狀態(tài)[8]，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺異常。中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有豐富的星形膠質(zhì)細(xì)胞。研究表明，在神經(jīng)病理性疼痛的形成和維持期，可出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大、活化增殖等現(xiàn)象，而過度活化增殖可導(dǎo)致炎性介質(zhì)釋放增加，從而加重?fù)p傷。脊髓背角神經(jīng)元上的Cdk5激活在慢性疼痛的傷害性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要作用，并成為鎮(zhèn)痛藥物作用的一個(gè)靶目標(biāo)[9]。然而神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，抑制Cdk5激活是否影響其他蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，目前尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，傷害性感受的存在依賴于中樞敏感化形成，在中樞敏感化過程中Cdk5激活被認(rèn)為是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。Cdk5是絲/蘇氨酸蛋白激酶，大部分Cdk5以單體形式存在，沒有激酶活性，只有與p35或p39結(jié)合才表現(xiàn)激酶活性，其中p35作為特異性蛋白結(jié)合及活化Cdk5的能力更強(qiáng)。研究表明，Cdk5與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元正常功能維持密切相關(guān)，可參與發(fā)育過程中神經(jīng)元的遷移、神經(jīng)突起的生長(zhǎng)、軸突運(yùn)輸、胞吐、藥物成癮等。近年研究發(fā)現(xiàn)，Cdk5在疼痛中發(fā)揮著重要作用[11]。研究表明，鞘內(nèi)注射Cdk5抑制劑Roscovitine可顯著減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛行為學(xué)，且不引起運(yùn)動(dòng)功能損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，I組各時(shí)間點(diǎn)PWMT、PWTL均低于S組，提示神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型制備成功；與I組比較，R組T5～T7時(shí)PWMT、PWTL均升高，提示抑制Cdk5抑制劑可有效減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛行為學(xué)表現(xiàn)。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物。星形膠質(zhì)細(xì)胞活化主要發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脊髓上水平(如延髓腹外側(cè)區(qū))和脊髓水平(主要是脊髓背角)[13]。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)病理性疼痛的維持有關(guān)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可緩解神經(jīng)病理性疼痛[14]。體外研究表明，Cdk5和p35除在神經(jīng)元表達(dá)外，還可表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，Cdk5、p35表達(dá)上調(diào)，給予Cdk5抑制劑Roscovitine能抑制損傷導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[15]。Cdk5和p35形成免疫復(fù)合物導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和進(jìn)一步延伸，在病理狀態(tài)下導(dǎo)致GFAP重構(gòu)增多[16]，引起星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，釋放一系列炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，這可能是神經(jīng)病理性疼痛維持的基礎(chǔ)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與I組比較，R組T5～T7時(shí)脊髓GFAP相對(duì)表達(dá)量均明顯下調(diào)，提示抑制Cdk5能使脊髓背角GFAP表達(dá)下調(diào)，表明Cdk5可參與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制過程，抑制Cdk5可能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而減輕神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所述，抑制Cdk5可減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制可能與抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)，進(jìn)而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。