沉默長鏈非編碼RNA HOTAIR對膀胱癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制

劉泓鍵，奉友剛，余周，康永明，賀煒，姜明東

(遂寧市中心醫院,四川遂寧629000)

膀胱癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，以膀胱移行性細胞癌最常見[1]。膀胱移行性細胞癌具有易侵襲、轉移和復發等生物學特性，但目前對膀胱癌的發病機制尚不明確。長鏈非編碼RNA(LncRNA)的轉錄本長度超過200 nt，位于細胞核或細胞質中，因缺乏開放閱讀框架而無法編碼蛋白質。研究認為，LncRNA與物種進化、胚胎發育、物質代謝以及腫瘤發生等有關[2]。LncRNA可在表觀遺傳學、轉錄或轉錄后水平等參與染色體的修飾、轉錄、翻譯等過程[3]。HOTAIR是一個長2 158 nt的反義LncRNA，其反式調控位點不在染色體的HOX基因簇，因而無法調控編碼該LncRNA自身的HOX基因簇[4]。HOTAIR一直被認為是一種原癌基因，在多種腫瘤組織中過表達，與腫瘤的發展、浸潤、轉移和不良預后有關[5]。HOTAIR可作為多梳抑制復合體2與組蛋白去甲基化酶的分子支架，通過調控組蛋白H3K27甲基化和H3K4去甲基化水平，使腫瘤轉移抑制基因表達沉默，同時誘導腫瘤轉移正向調控基因表達，從而促進腫瘤轉移[6]。Notch信號通路蛋白1(Notch1)、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、趨化因子受體2(CXCR2)、上皮性黏附蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)基因與細胞增殖、凋亡等密切相關。目前，關于HOTAIR對膀胱癌細胞增殖、凋亡影響的報道較少。2017年5月～2018年3月，我們觀察了沉默LncRNA HOTAIR對膀胱癌細胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌253J細胞株購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。DMEM，江蘇凱基生物技術股份有限公司；FBS，以色列BI公司；si-HOTAIR(可沉默HOTAIR表達)及空載體陰性序列(Vector)均由上海生工生物工程股份有限公司合成，si-HOTAIR序列上游引物5′-GATCCGCCTTTG-GAAGCTCTTGAAGGCTCGAGCCTTCAAGAGCTTCC-AAAGGCTTTTTG-3′，下游引物5′-AATTCAAAAAGC-CTTTGGAAGCTCTTGAAGGCTCGAGCCTTCAAGAG-CTTCCAAAGGCG-3′；Vector上游引物5′-GATCC-TTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′，下游引物5′-A-ATTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCT-TGAATTACGTGACACGTTCGGAGAAG-3′。TRIzon Reagent、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture，北京康為世紀生物科技有限公司；熒光定量PCR儀，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 細胞分組及si-HOTAIR干擾方法 取適量對數生長期253J細胞，隨機分為si-HOTAIR干擾組、空載體組、對照組，每組設6個復孔，待細胞生長融合達90%時，si-HOTAIR干擾組、空載體組分別轉染si-HOTAIR、Vector，對照組不做任何處理，然后將各組細胞放回孵箱繼續培養，轉染4 h更換為含血清的完全培養基培養。

1.3 各組細胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取各組轉染4 h細胞，棄培養基，每孔加入新配制的CCK-8溶液10 μL，繼續培養4 h。采用酶標儀檢測各組450 nm波長處的光密度(OD)值。以OD450值代表細胞增殖能力。實驗重復3次，取平均值。

1.4 各組細胞凋亡情況觀察 采用Hoechst法。取各組轉染4 h細胞，固定，Hoechst 33258染色液染色5 min。充分混勻，振蕩洗滌，于載玻片上加入相應的抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常藍色，而凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，計數凋亡細胞數。實驗重復3次，取平均值。

1.5 各組細胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。取各組轉染4 h細胞，TRIzol法提取總RNA,RQ1 RNase-Free DNase去除基因組DNA，NanoDrop2000檢測RNA濃度。根據Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit建立20 μL反應體系，將總RNA逆轉錄為cDNA。嚴格按照SYBR Green PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。引物序列：Notch1上游引物5′-CTTTGTGCTTCTGTTCTTCGTG-3′，下游引物5′-CGCCGCTTCTTCTTGCT-3′；EpCAM上游引物5′-TTCGGGCTTCTGCTTGC-3′，下游引物5′-CCCTTCAGGTTTTGCTCTTC-3′；CXCR2上游引物5′-ATGTCTCAGCATCTGGGGTCT-3′，下游引物5′-GCAGGGTGAATCCGTAGCA-3′；E-cadherin上游引物5′-ATCTGAAAGCGGCTGATACTG-3′；下游引物5′-TGCCCCATTCGTTCAAGTA-3′；MMP-2上游引物5′-CCGCAGTGACGGAAAGA-3′，下游引物5′-TGGTGTAGGTGTAAATGGGTG-3′；Vimentin 上游引物5′-TCGTGATGCTGAGAAGTTTCG-3′，下游引物5′-TCTGGATTCACTCCCTCTGGT-3′；α-SMA上游引物5′-GCGTGGCTATTCCTTCGT-3′，下游引物5′-TCAGGCAACTCGTAACTCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物5′-GAGAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。反應體系：RNase Free dH2O 9.5 μL，cDNA/DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40個循環。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt法計算HOTAIR、Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 轉染4 h，si-HOTAIR干擾組、空載體組、對照組細胞增殖能力分別為0.38±0.02、0.89±0.01、0.89±0.02。與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組細胞增殖能力明顯下降(P均<0.05)，而對照組與空載體組比較P>0.05。

2.2 各組凋亡細胞數比較 轉染4 h，si-HOTAIR干擾組、空載體組、對照組凋亡細胞數分別為(33.56±2.26)、(13.69±1.25)、(12.85±1.35)個。與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組凋亡細胞數明顯升高(P均<0.05)，而對照組與空載體組比較P>0.05。

2.3 各組細胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA表達比較 見表1。

表1 各組細胞Notch1、EpCAM、CXCR2、E-cadherin、Vimentin、MMP-2和α-SMA mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與空載體組比較，#P<0.05。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，具有易侵襲、轉移和復發等生物學特性，但其病因及發病機制尚不十分清楚。

HTOAIR是一種由2 158個堿基組成的長鏈非編碼RNA，是一種原癌基因，在多種腫瘤組織中過表達，與腫瘤的發展、浸潤、轉移和不良預后有關。Gupta等[7]研究發現，HTOAIR與多梳抑制復合體2結合，可誘導H3組蛋白的第27位賴氨酸甲基化，造成JAM2、PCDH10和PCDHB5等腫瘤轉移抑制基因在表觀遺傳水平上達到基因沉默的效果。Wu等[8]觀察HOTAIR與腎癌細胞增殖和腫瘤形成的關系發現，隨HOTAIR表達增加，腎癌細胞增殖能力顯著增強，p16、p21、p53等細胞周期相關蛋白表達異常；進一步動物實驗發現，裸鼠腫瘤重量亦顯著增加；基因芯片檢測表明，敲除HOTAIR基因可減弱HOTAIR招募H3K27me3后結合蛋白的能力。Yang等[9]研究發現，HOTAIR高表達與肝癌的轉移和復發以及肝癌細胞的耐藥性密切相關。本研究結果發現，與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組細胞增殖能力明顯下降，凋亡細胞數明顯升高，說明下調HOTAIR表達可抑制膀胱癌細胞增殖并促進其凋亡。

Notch基因在各種生物體內廣泛存在，并具有高度同源性[10]。Notch及其相關基因在進化上高度保守，在細胞分化和胚胎發育中發揮重要作用。本研究結果發現，與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組Notch1 mRNA相對表達量下降，說明HOTAIR可能通過影響Notch1表達影響細胞凋亡。EpCAM可通過激活cyclin A/E、c-myc基因等相關原癌基因的表達，從而起到致瘤作用[11]。EpCAM在鱗癌、乳腺癌等多種上皮性相關腫瘤組織中高表達，可作為上皮性腫瘤診斷和治療的一種候選蛋白。本研究結果發現，與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組EpCAM mRNA相對表達量下降，表明EpCAM表達降低可能通過抑制某些原癌基因表達起抑瘤作用。E-cadherin是一種鈣依賴性細胞黏附分子，通過同型細胞連接維持細胞形態結構完整性，E-cadherin蛋白表達降低也是EMT的一個重要標志[12]。Vimentin屬于中間絲蛋白，具有維持細胞與細胞器的形態、信號傳導、移植免疫及細胞調亡等多種生物學功能[13]。Vimentin表達異常能夠使細胞骨架蛋白構成明顯改變，上皮細胞的形態從立方形發展為紡錘形的纖維樣細胞，因此會易于遷移和游走。α-SMA能夠調節細胞運動。有研究表明，α-SMA表達可促使EMT改變，而EMT可參與生長發育、損傷修復、腫瘤轉移和多種纖維化疾病的發生、發展過程[14]。本研究結果發現，與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組Vimentin、α-SMA mRNA相對表達量均明顯下降，E-cadherin mRNA相對表達量明顯升高，說明HOTAIR可通過影響E-cadherin、Vimentin和α-SMA表達，進一步調控膀胱癌的生物學特征。趨化因子CXC家族有5種受體，CXCR1和CXCR2均為趨化因子受體，其在乳腺癌、結腸癌、膀胱癌等細胞中均過表達，抗體封閉CXCR1和CXCR2則可抑制腫瘤生長和轉移[15]。本研究結果發現，與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組CXCR2 mRNA相對表達量下降，說明HOTAIR可通過下調CXCR2表達，進一步影響腫瘤生長。MMPs是一類鋅離子依賴性內肽酶，能夠降解細胞外基質，從而促進腫瘤的浸潤和轉移。MMP-2是MMPs比較重要的一個亞型，在乳腺癌、卵巢癌及鼻咽癌等組織中高表達[16]。本研究結果發現，與對照組、空載體組比較，si-HOTAIR組MMP-2 mRNA相對表達量下降，說明HOTAIR可能通過影響MMP-2的表達，參與膀胱癌的轉移。

綜上所述，沉默LncRNA HOTAIR表達可抑制膀胱癌細胞增殖并促進其凋亡，其作用機制可能與抑制Notch1、EpCAM、CXCR2、Vimentin、MMP-2和α-SMA表達，促進E-cadherin表達有關。