微小RNA-17在幽門螺桿菌相關胃癌組織中的表達變化及意義

朱艷麗，杜井峰，蘇德望，劉亮，程卓鑫，張雪梅

(1佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154002；2佳木斯市腫瘤醫院)

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率與病死率均居所有惡性腫瘤的前三位[1]。胃癌的病因尚不完全清楚，目前認為幽門螺桿菌(Hp)感染與胃癌的發生、發展密切相關，而且WHO已將其列為Ⅰ類致病原[2]。Hp感染在誘導胃黏膜細胞發生炎癥反應時，可刺激或抑制微小RNA(miRNA)基因表達，有可能作為抑癌基因或促癌基因參與胃癌的發生、發展[3,4]。細胞毒素相關基因A(CagA)蛋白是Hp Cag致病島上CagA基因編碼的產物，亦是Hp感染導致宿主炎性反應的重要效應蛋白。微小RNA-17(miR-17)可作為促癌基因參與腦膠質瘤、結腸癌細胞增殖、侵襲、轉移[5,6]。但其在胃癌組織特別是Hp陽性胃癌組織中的表達變化鮮見報道。2016年1月～2017年9月，本研究觀察了miR-17在Hp相關胃癌組織中的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集同期就診于佳木斯大學附屬第一醫院的胃癌患者75例，均經病理檢查確診，其中Hp陽性48例、Hp陰性27例。48例Hp陽性胃癌患者中，男30例、女18例，年齡>60歲16例、≤60歲32例；腫瘤直徑：≤5 cm 28例，>5 cm 20例；組織分化程度：中度14例，低度34例；臨床分期(國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會第8版)[7]：Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期20例；Borrmann分型：Ⅰ、Ⅱ型26例，Ⅲ、Ⅳ型22例；有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移27例。本研究經佳木斯大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。

1.2 細胞毒素相關基因A(CagA)mRNA表達檢測 取手術切除的胃癌組織標本，常規固定、脫水、包埋、切片、染色，采用實時定量PCR法檢測CagA mRNA表達。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。正向引物：5′-GATAACAGGCAAGCTTTGAGG-3′；反向引物：5′-CTGCAAAGATTGTTTGCGAGA-3′。總DNA提取：取胃癌組織標本，石蠟塊切片，經二甲苯脫蠟，使用消化液消化，采用酚-氯仿提取DNA。按PCR試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性60 s、50 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s共30個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算CagA mRNA相對表達量。

1.3 miR-17表達檢測 總RNA提取：取胃癌組織及癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>10 cm)標本，于液氮中碾磨成粉狀，根據TRIzol說明提取組織總RNA，使用DEPC處理后蒸餾水溶解。經Biophotometer分光光度計鑒定，A260/A280為1.8～2.0，說明提取的總RNA濃度與純度合格。按反轉錄試劑盒說明將總RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。按PCR試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-17相對表達量。

2 結果

2.1 Hp陽性、陰性胃癌組織CagA mRNA表達比較 Hp陽性、陰性胃癌組織CagA mRNA相對表達量分別為6.061±0.712、1.024±0.235。Hp陽性胃癌組織CagA mRNA相對表達量高于Hp陰性胃癌組織(t=35.593,P<0.05)。

2.2 Hp陽性、陰性胃癌組織miR-17表達比較 Hp陽性胃癌組織、癌旁組織miR-17表達均高于Hp陰性胃癌組織及癌旁組織(P均<0.01)；Hp陽性、陰性胃癌組織miR-17表達高于癌旁組織(P均<0.01)。見表1。

表1 Hp陽性、陰性胃癌組織及癌旁組織miR-17表達比較

注：與Hp陰性比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05。

2.3 miR-17表達與Hp陽性胃癌患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、組織分化程度Hp陽性胃癌患者miR-17表達比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；腫瘤直徑>5 cm，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期，Borrmann分型Ⅲ、Ⅳ型以及有淋巴結轉移者miR-17表達高于腫瘤直徑≤5 cm，臨床分期Ⅰ、Ⅱ期，Borrmann分型Ⅰ、Ⅱ型以及無淋巴結轉移者(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-17表達與Hp陽性胃癌患者臨床病理特征的關系

2.4 胃癌組織miR-17表達與CagA表達的關系 胃癌組織miR-17表達與CagA表達呈正相關關系(r=0.564,P<0.01)。

2.5 miR-17表達與Hp陽性胃癌患者預后的關系 根據miR-17表達差異，以差異大于2倍為分界點將Hp陽性胃癌患者分為高表達30例和低表達18例。miR-17高表達Hp陽性胃癌患者生存時間為(27.65±4.12)個月，miR-17低表達Hp陽性胃癌患者生存時間為(34.74±5.32)個月。miR-17高表達Hp陽性胃癌患者平均生存時間明顯短于miR-17低表達Hp陽性胃癌患者(t=5.170,P<0.05)。

3 討論

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，具有高度保守性、時序性與組織特異性，在腫瘤的發生、發展過程中具有重要作用。因miRNA的結構穩定、不易被降解，被認為是具有廣泛應用前景的腫瘤標志物，可用于腫瘤早期篩查、預后判斷[8，9]。miR-17定位于人13號染色體，屬于miR-17-92基因家族一員，在宮頸癌[10]、膽管癌[11]、食管癌[12]等組織或患者血清中高表達，可能作為一種促癌基因，參與腫瘤的發生、發展[13，14]。

Hp為單級、多鞭毛、螺旋形彎曲的革蘭陰性菌，能分泌毒力因子，可寄居于胃黏膜表面，能刺激胃黏膜炎癥、免疫反應。Hp致病性取決于細菌毒力因子與宿主細胞應答等相關因素[15，16]。CagA蛋白是Hp Cag致病島上CagA基因編碼的產物，亦是Hp感染導致宿主炎性反應的重要效應蛋白，可引起胃黏膜慢性炎癥損傷，增加胃癌發生風險[17]。馬連君等[18]研究報道，Hp陽性胃癌組織CagA mRNA表達高于Hp陰性胃癌組織。本研究結果與之相符，并發現胃癌組織miR-17表達與CagA mRNA表達呈正相關關系。本研究還發現，Hp陽性胃癌組織、癌旁組織miR-17表達高于Hp陰性胃癌組織及癌旁組織，Hp陽性、陰性胃癌組織miR-17表達高于Hp陽性、陰性癌旁組織，提示Hp感染可誘導刺激miR-17表達。

有研究表明，miR-17可通過p21p、53INP1等途徑誘導胃癌細胞增殖并抑制其凋亡[19]，但這種作用在不同病理特征患者中效果各不相同[20，21]。本研究結果表明，Hp陽性胃癌患者miR-17表達與腫瘤直徑、臨床分期、Borrmann分型、淋巴結轉移有關，與姜雙等[22]報道類似。本研究還發現，miR-17高表達者Hp陽性胃癌中患者生存時間明顯短于miR-17低表達Hp陽性胃癌者，說明miR-17可能參與Hp相關胃癌的發生、發展。

綜上所述，miR-17在Hp相關胃癌組織中的表達異常升高，且與腫瘤直徑、臨床分期、Borrmann分型、淋巴結轉移及患者預后有關。miR-17有可能作為Hp相關胃癌早期診斷及預后判斷的候選標志物。