重癥肌無力患者血清microRNA-146a水平變化及其生物信息學分析

黃攀，徐敏，何曉英,王淳

(1 德陽市人民醫院，四川德陽618000；2 德陽市第二人民醫院；3 西南醫科大學附屬醫院)

重癥肌無力(MG)是一種由于神經-肌肉接頭突觸后膜上乙酰膽堿受體(AChR)受損導致的神經-肌肉接頭傳遞功能障礙性疾病[1]。其主要臨床表現為部分或全身骨骼肌無力，易疲勞，活動后癥狀加重，充分休息或膽堿酯酶抑制劑治療后癥狀可減輕。MG病情易反復并可出現多種危象，給社會和家庭造成沉重負擔。目前認為，MG是一種與遺傳因素有關的獲得性自身免疫性疾病[2]。microRNA是一類長度為17～22個核苷酸的單鏈小分子物質，通過完全或非完全堿基互補配對原則與特定靶基因mRNA的3′端非編碼區結合，從而抑制mRNA翻譯或降解其特定mRNA，繼而參與機體生長發育、疾病發生的調控[3]。有研究發現，microRNA-146a在多種免疫性疾病中存在差異表達[4，5]，提示其具有調控炎癥免疫反應的作用，但鮮見MG患者microRNA-146a差異表達情況的報道。因此，本研究觀察了MG患者血清micro-RNA-146a水平變化，并通過生物信息學方法分析microRNA-146a靶基因的功能富集和信號通路富集情況，以期從基因學角度進一步闡述MG的發病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年7月～2018年1月德陽市人民醫院收治的MG患者108例(MG組)。納入標準：①符合重癥肌無力診斷和治療的中國專家共識[6]；②首次確診且未行治療；③臨床資料完整；④神志清楚，能配合本研究。排除標準：①合并自身免疫性疾病；②正在使用抑制免疫功能的藥物；③合并嚴重內科系統疾病；④合并其他神經-肌肉疾病。其中，男47例、女61例，年齡(37.47±8.21)歲。另選同期體檢健康者50例(對照組)，男20例、女30例，年齡(39.25±8.34)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經德陽市人民醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 血清microRNA-146a檢測 空腹采集外周靜脈血5 mL，室溫下自然凝固15 min，3 000 r/min離心30 min，收集上層血清。主要試劑和儀器：TRIzol Reagent、10 mmol/L dNTP Mix、M-MLV逆轉錄酶購于美國Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq購于日本TaKaRa公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司；熒光定量PCR儀購于美國Life Technologies公司；PCR儀購于杭州博日科技有限公司；臺式離心機購于上海安亭科學儀器廠。檢測方法：①血清總RNA提取及質檢。取200 μL血清置于冰上融化，加入1 mL TRIzol，充分混勻，靜置5 min后加入三氯甲烷250 μL，再充分混勻，置于冰上靜置5 min。將上述混合液4 ℃下以10 000 g離心10 min，在超凈工作臺中小心吸取上清500 μL于1.5 mL EP管中；加入4 ℃預冷的等體積異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃靜置15 min。將上述溶液在4 ℃下以10 000 g離心10 min，小心棄掉液體；加入1 mL 4 ℃預冷的75%乙醇，顛倒數次，清洗RNA沉淀；再于4 ℃下以10 000 g離心5 min，棄掉液體；于超凈工作臺中干燥數分鐘，將乙醇充分揮發干凈，加入10 μL RNase-Free Water溶解RNA。采用核酸蛋白測定儀測定所提取RNA的OD260、OD280值，OD260/OD280為1.8～2.0，表明所提取的RNA純度較高。②RT-PCR反應。第一鏈cDNA的合成采用M-MLV逆轉錄酶試劑盒，將內參基因和目的基因特異性逆轉錄引物各1.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、RNA 10 μL、5×第一鏈合成緩沖液4.0 μL、DTT 2.0 μL、M-MLV逆轉錄酶1.0 μL，按說明書置于反應體系中，按照95 ℃ 5 min、37 ℃ 50 min的方式反轉錄為cDNA。將前述制備的反應混合液置于96孔板中，按操作步驟加入2×qPCR Mix 5.0 μL、引物工作液1.0 μL、Template 1.0 μL、ddH2O 2.8 μL、Rox 0.2 μL。擴增條件:95 ℃ 1 min;95 ℃、15 s，58 ℃、20 s，72 ℃、45 s，共40個循環。microRNA-146a上游引物5′-CCTGAGAAGTGAATTCCATGGG-3′、下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′，內參基因U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。每樣本設3個復孔。采用2-ΔCt法計算microRNA-146a相對水平。

1.3 microRNA-146a生物信息學分析 采用美國加州大學圣克魯茲分校研制的UCSC基因組在線工具(http://genome-asia.ucsc.edu)分析microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性；運用Targetscan數據庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)及CoMeTa數據庫(https://www.cometasystems.com/)預測microRNA-146a的靶基因；采用DAVID數據庫分析microRNA-146a靶基因的功能富集(GO富集)和信號通路富集(KEGG Pathway)。

2 結果

2.1 兩組血清microRNA-146a水平比較 MG組血清microRNA-146a相對水平為2.13±0.63，高于對照組的0.86±0.38(P<0.05)。

2.2 microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性 microRNA-146a定位于5q33.3人染色體上160485325～160485450，長度為99 bp，并且其核苷酸序列在人、恒河猴、小鼠、狗、大象、雞6個物種中高度保守。

2.3 microRNA-146a靶基因預測結果 使用Targetscan數據庫預測microRNA-146的靶基因共251個，而CoMeTa數據庫預測靶基因共939個。兩個數據庫同時出現的靶基因有88個(ERBB4、IRAK1、WWC2、TAF9B、USP47、ABL2、BMPR1A、CDC14A、CLCN6、RNF32、ZNF148、MYO6、MARK1、SORT1、IGSF1、MMP16、SLC2A3、SEC23IP、CNTF、NRP2、QKI、BAG1、ARMC8、RARB、TDRKH、NRAS、FRYL、FBXW2、GRSF1、C10orf76、PHOX2B、MYT1、CAMSAP1、FLOT2、CCDC6、STC1、SEMA3G、TCF21、TANC2、LTB、EDNRB、ROBO1、EIF5A2、RABGAP1、RUNX1T1、LRRC15、SMAD4、VAT1、POU3F2、LFNG、BNC1、MYBL1、SYT1、SIAH2、TRAF6、DGKG、KLF7、CD80、CDON、BCORL1、CARD10、DNPEP、SLI1、TRK3、RNASEL、C16orf72、LRP2、PRX、KCMF1、NUMB、KIF24、ZNF532、PPP1R11、RIMS2、NOVA1、DLGAP2、SH3GL2、EIF4G2、MFHAS1、FBXO28、KPNA6、NF2、STRN、CASK、PBX2、SLC10A3、USP3、SCN3B、PGK1)。這些靶基因在基因轉錄、免疫球蛋白、炎癥反應、鈣調素調節蛋白生成、突觸分化等過程中發揮重要作用。

2.4 microRNA-146潛在靶基因的功能富集 采用DAVID數據庫對88個交集潛在靶基因進行功能富集分析，發現microRNA-146a靶基因功能主要富集于細胞增殖調控、神經元分化、磷代謝反應、免疫炎癥反應、細胞因子合成等22個生物學過程中。見表1。

表1 microRNA-146a靶基因GO分析結果

2.5 microRNA-146潛在靶基因的信號通路富集 microRNA-146a靶基因主要富集于Toll樣受體信號通路、腫瘤信號通路、神經遞質調節信號通路、病毒性心肌炎信號通路、EB信號通路5條信號通路中。其中，Toll受體是一種與免疫及炎癥反應密切相關的信號通路，且已經被證實與MG發病有關。見表2。

3 討論

1895年Jolly首次命名了MG，其后相關報道逐漸增多[7]。MG最初被認為是一種AChR抗體介導的自身免疫性疾病，該抗體可引起突觸后膜大量的AChR被破壞，進而導致終板電位不能產生，最終因突觸后膜傳遞功能障礙而出現肌無力表現[8]。近年來，隨著家族性MG的發現，人們逐漸認識到MG與人類白細胞抗原關系密切，由此推測MG是一種與遺傳因素密切相關的自身免疫性疾病[9，10]。但目前MG與遺傳因素的研究較少。因此，有必要進一步對MG發病的遺傳因素進行研究。

表2 microRNA-146a潛在靶基因KEGG Pathway結果

microRNA是一類具有重要調控作用的非編碼小分子RNA，在人體內通過與其特定靶基因的結合，進而發揮調控多條信號通路的作用，免疫炎癥反應信號通路便是其中之一。microRNA-146a被認為具有調控免疫炎癥反應的作用。有研究發現，microRNA-146a可通過抑制TRAF6/NF-κB信號通路減輕腰椎間盤的炎癥反應[11]；另有研究發現，在阿爾茨海默病患者腦中，下調的microRNA-146a可以通過TLR信號途徑促進固有免疫反應，進而促進阿爾茨海默病的發生[12]。本研究中，通過對比MG患者和體檢健康者外周血清microRNA-146a水平發現，MG患者血清microRNA-146a水平明顯高于體檢健康者，提示microRNA-146a可能與MG的發病密切相關，這與Yan等[13]的研究結論相似。

microRNA通過與特定靶基因mRNA結合進而發揮相應的生物學功能。為進一步明確microRNA-146a潛在的靶基因，我們采用生物信息學方法進行預測。目前，microRNA靶基因的預測數據庫眾多，TargetScan數據庫和CoMeTa數據庫是較為常用的兩種。本研究通過繪制Venn圖[14]，取以上兩種數據庫的交集作為microRNA-146a潛在靶基因，大大提高了預測的準確性；結果發現，microRNA-146a潛在的靶基因有ERBB4、NUMB、CD80、TRAF6、IRAK1等88種。神經調節蛋白(NRG)是一種神經元來源的營養因子，具有支持神經肌肉發育的作用，而ERBB4則是NRG的受體之一[15]。此外，NRG-ERBB4信號通路還在突觸的形成及軸突導向的調節等過程中發揮重要作用。有研究還發現，microRNA-146a可以調控ERBB4的表達，進而抑制胃癌細胞的轉移和增殖[16]。p53是一種眾所周知的抑癌基因，NUMB基因的表達產物NUMB蛋白可以抑制p53的活性進而增加小腸腺癌組織中的免疫活性[17]。T細胞的活化是免疫應答反應的重要過程，而免疫突觸的形成在T細胞活化過程中具有重要作用，CD80是免疫突觸形成過程中重要的協同刺激分子[18]。TRAF6是TLR信號通路的主要介導因子，廣泛參與介導炎癥與免疫反應[19]。IRAK1是介導免疫和炎癥反應的TLR和白細胞介素1受體信號通路中的重要分子[20]。

對靶基因進行功能富集分析和KEGG信號通路分析，有利于尋找和預測與疾病發生有關的分子調控網絡。DAVID6.7數據庫是常用的預測軟件。本研究采用DAVID數據庫對microRNA-146a靶基因功能GO富集發現，相關靶基因分子主要富集于細胞增殖調控、神經元分化、磷代謝反應、免疫炎癥反應、細胞因子合成等生物學過程中；而KEGG Pathway結果顯示，microRNA-146a主要富集于TLR[21]、神經遞質調節、病毒性心肌炎、EB等多個信號傳導通路。研究表明，TLR家族中的TLR9與MG發病關系密切，TLR9可以通過TRAF6和CD88途徑促進INF-α表達，進一步激活自身反應性淋巴細胞，從而導致MG的發病[22]。有研究發現，MG患者胸腺組織EB病毒含量較正常人增高，提示EB病毒與自身免疫性疾病有一定關系，但具體關系還需進一步研究證實[23，24]。

綜上所述，MG患者血清microRNA-146a水平升高；通過生物信息學方法分析發現，microRNA-146a可能通過調控多條信號通路中的多種靶基因，參與MG的發病。這為進一步闡明MG發病過程中的分子調控網絡提供了更多的依據。但本研究樣本量較少且為單中心研究，其結論可能存在一定偏倚，今后需更多大樣本、多中心研究進行驗證。