快速老化癡呆小鼠海馬組織差異表達基因模式分析及治療藥物預測

劉濤,張雪竹,賈玉潔,韓景獻,聶坤

(天津中醫藥大學第一附屬醫院,天津300193)

阿爾茨海默病是一種常見的神經退行性疾病，主要臨床表現為進行性記憶障礙、失語、認知能力下降，其發病機制目前尚不明確[1]。老化是阿爾茨海默病的危險因素，但并不是所有人在老化過程中均出現阿爾茨海默病。因此，揭示阿爾茨海默病獨有的老化模式，有助于闡明老化在阿爾茨海默病發生、發展過程中的作用機制。基于大數據的系統生物學分析方法為定性分析阿爾茨海默病的老化模式提供了可能性。美國國立衛生研究院NIH資助建立的網絡集成式細胞內特征的公共數據(LINCS)項目(http://www.lincsproject.org/)，開發了Connectivity Map(Cmap)數據庫，收集使用化合物處理和相關基因干擾劑處理的人類細胞基因表達信息。Cmap數據庫包含大量細胞水平反應模式數據，同時開發了多種系統生物學分析工具，可從樣品的基因組學數據進行模式化定性分析，揭示某種干預手段或藥物處理對細胞基因表達模式的影響及可能機制[3]。SAMP8小鼠是一種典型的快速老化癡呆小鼠，在成年期即可出現典型伴隨癡呆的快速老化特征，是常用的阿爾茨海默病動物模型[4]。2016年1月～2017年12月，我們分析了SAMP8小鼠及SAMR1小鼠海馬組織差異表達基因，利用LINCS數據庫模式化分析快速老化癡呆小鼠海馬組織差異表達基因特征，并預測老年癡呆的治療藥物。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡(幼年)、8月齡(老年)SAMP8小鼠各20只(雌雄各半)，2月齡(幼年)、8月齡(老年)SAMR1小鼠各20只(雌雄各半)，均由天津中醫學院第一附屬醫院實驗動物中心提供[動物許可證號SXCK(津)2015-0003]，飼養條件完全相同，自由攝食飲水。芯片雜交使用美國Affymetrix公司的Affymetrix GeneChip 645 System；芯片信號掃描使用Affymetrix公司的GeneChip 7G microarray scanner；TRIzol購自美國Invitrogen公司；小鼠基因芯片Affymetrix GeneChip Mouse Transcriptome Array1.0購自美國Affymetrix公司。

1.2 SAMP8、SAMR1小鼠海馬組織差異表達基因抽提 頸椎脫臼法處死2月齡、8月齡SAMP8和SAMR1小鼠，取海馬組織，置于預冷的玻璃勻漿器中勻漿，TRIzol法提取細胞總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。每月齡小鼠分別保留3份RNA樣品制作基因芯片(版本號： Affymetrix GeneChip Mouse Transcriptome Array 1.0)。探針合成、芯片雜交與洗染、芯片掃描、數據初步分析均由北京博朗生科技有限公司完成。采用LINCS(http://lincs-dcic.org/)項目下GEO2Enrichr在線分析工具抽提和分析差異表達基因。統計學分析方法選擇Characteristic Direction，以3個幼年SAMP8小鼠海馬組織芯片作為對照，從3個老年SAMP8小鼠芯片數據中抽提具有統計學意義的差異表達基因(校正P<0.05)。同樣方法抽提SAMR1老年小鼠具有統計學意義的差異表達基因。

1.3 快速老化相關基因GO富集、KEGG代謝途徑分析 將上述差異表達基因導入富集分析工具Enrichr進行生物信息學分析。對差異表達快速老化基因進行GO富集分析，揭示其主要細胞定位、分子功能，P<0.05為差異有統計學意義。采用KEGG代謝途徑分析差異表達快速老化基因的功能及代謝通路。

1.4 差異表達快速老化相關基因模式定性分析及治療藥物預測 使用LINCS項目下CREEDS網絡在線分析工具對差異表達快速老化基因模式進行定性分析，查詢與未知樣本基因表達特征模式有相似或相反特征的LINCS數據庫中已知表達模式[5]，采用小分子藥物模塊定性分析預測老年性癡呆的治療藥物。

2 結果

2.1 SAMP8、SAMR1小鼠海馬組織差異表達基因篩選結果 伴隨快速老化過程，SAMP8小鼠海馬組織表達上調基因808個、表達下調基因186個；伴隨正常老化過程，SAMR1小鼠海馬組織表達上調基因306個、表達下調基因599個。進一步分析發現，SAMP8小鼠海馬組織基因表達模式以上調為主要特征，SAMR1小鼠海馬組織基因表達模式以下調為主要特征，二者共有61個表達上調基因和68個表達下調基因。SAMP8小鼠海馬組織快速老化基因表達模式中，去掉共有基因，還有747個表達上調基因和245個表達下調基因具有特異性。

2.2 快速老化基因GO功能富集分析結果 表達上調基因中多個富集詞條具有統計學意義，747個表達上調基因轉錄為蛋白質后主要定位于細胞質核糖體和線粒體，見表1；主要生物學過程是細胞中蛋白質合成分選、定位以及病毒核酸合成，見表2；主要分子功能是NADH 還原酶活性(NADH dehydrogenase activity,GO:0008137,校正P=3.138E-6)；245個表達下調基因分析結果差異均無統計學意義。SAMR1基因表達模式中，去掉共有基因，共有118個表達上調基因和531個表達下調基因具有特異性，GO功能富集分析結果未發現表達上調、下調基因差異有統計學意義。

表1 SAMP8小鼠海馬組織表達上調基因細胞內定位的GO功能富集分析結果

表2 SAMP8小鼠海馬組織表達上調基因生物學過程的GO功能富集分析結果

2.3 快速老化相關基因KEGG代謝途徑分析結果 見表3。SAMP8小鼠海馬組織基因表達模式中，747個表達上調基因有統計學意義的KEGG代謝網絡途徑，主要為線粒體氧化磷酸化途徑、3種神經退行性疾病代謝途徑(阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病)、核糖體蛋白質合成途徑及非酒精性脂肪肝、大腸桿菌感染代謝網絡途徑；245個表達下調基因分析結果差異均無統計學意義。SAMR1小鼠海馬組織基因表達模式中，118個表達上調基因和531個表達下調基因的KEGG代謝網絡途徑差異均無統計學意義。

表3 SAMP8小鼠海馬組織表達上調基因的KEGG代謝網絡途徑分析結果

2.4 快速老化相關差異表達基因模式定性分析結果 單基因模塊定性分析結果顯示，與SAMP8小鼠基因表達模式匹配度排名靠前的單基因模塊是Psap(GEO ID：GSE8307)；與SAMR1小鼠基因表達模式相似度最高的單基因模塊是Pink1(GEO ID：GSE60413)。結果表明，SAMP8小鼠海馬組織對快速老化產生的反應模式與Psap 基因過表達的反應模式匹配度最高，而SAMR1小鼠則與Pink1基因過表達的反應模式匹配度最高。

2.5 快速老化相關差異表達基因治療藥物預測結果 小分子藥物模塊定性分析結果顯示，與SAMP8小鼠基因表達模式匹配度最高的小分子藥物模塊是煙酰胺核糖(維生素PP，GEO ID：GSE62194)；與SAMR1小鼠基因表達模式匹配度最高的小分子藥物模塊是Deltamethrin(GEO ID：GSE7955)。結果表明，維生素PP能模擬SAMP8小鼠海馬組織細胞的基因表達模式，理論上可用于快速老化相關癡呆的治療藥物。

3 討論

老化過程中細胞各項生理活動都處于逐漸衰退狀態，各種功能基因的表達逐漸降低[6]。在SAMR1小鼠海馬組織中快速老化基因轉錄水平降低，表達下調的基因數目遠遠多于表達上調基因。但SAMP8小鼠的快速老化模式與SAMR1小鼠正常老化模式明顯不同，SAMP8小鼠海馬組織中快速老化基因表達上調，且表達上調的基因數目遠多于下調基因。上述結果表明，癡呆相關快速老化過程存在異常活躍的基因轉錄。

SAMR1小鼠海馬組織中上調與下調基因散在、無序，因而在GO生物信息學分析和KEGG代謝網絡途徑分析中，無論是表達上調基因還是表達下調基因，均未出現有統計學意義的結果；SAMP8小鼠海馬組織表達上調基因的GO分析和KEGG代謝途徑分析結果均表現出明顯集中性和富集特征，表達上調基因的細胞定位主要是核糖體和線粒體，表明大量的線粒體相關蛋白質在核糖體翻譯合成；主要生物學功能是細胞中蛋白質合成分選、定位，表明很多基因參與新合成的線粒體蛋白質從核糖體轉運到線粒體過程；主要分子功能是NADH還原酶活性，表明有很多快速老化基因參與線粒體氧化磷酸化過程[7]。線粒體相關基因高表達是細胞修復受損線粒體應激反應的主要特征。GO生物信息學分析結果提示，SAMP8小鼠癡呆相關的基因表達模式是一種特殊的細胞線粒體修復模式。KEGG代謝網絡途徑分析結果也支持這個觀點。SAMP8小鼠海馬組織表達上調基因涉及的關鍵代謝網絡途徑中，排在首位的是線粒體氧化磷酸化代謝途徑[8]，有統計學意義的代謝途徑還包括核糖體蛋白質合成途徑以及3種神經退行性疾病代謝途徑，表明SAMP8小鼠癡呆相關的基因表達模式具有典型的神經退行性疾病模式特征。

CREEDS分析工具的模擬效應模式定性分析結果顯示，SAMR1小鼠海馬組織快速老化基因表達模式類似于Pink1基因過表達模式。Pink1是一種蛋白激酶，能在身體任何細胞中表達，在大腦等耗能高的器官中表達尤為突出。在神經元內，主要位于線粒體內膜，Pink1可觸發線粒體自噬過程，是線粒體功能衰退的標志[9]。這表明正常老化模式是一種以線粒體功能衰退為特征的模式。SAMP8小鼠海馬組織快速老化模式則類似Psap基因過表達模式。Psap基因過表達模式是一種典型的神經元保護模式。Psap是一種鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)，也是一個高度保守的糖蛋白。在神經系統中，分泌型Prosaposin是一種神經營養因子和髓鞘營養因子, 其鞘脂激活蛋白C區的N末端14個氨基酸殘基具有營養活化功能；腦損傷后,Prosaposin過表達具有神經保護和神經營養的雙重特性[10]。結果提示，與正常老化的線粒體功能衰退模式不同，快速老化模式以神經元保護功能為主要特征。

小分子藥物模塊定性分析結果提示，線粒體在癡呆小鼠生物學機制具有關鍵作用。維生素PP是人體13種必需維生素之一。煙酸在人體內轉化為煙酰胺，煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內脂質代謝，組織呼吸的氧化過程和糖類的無氧分解過程。研究發現，維生素PP可促進線粒體電子傳遞鏈蛋白表達，提高線粒體膜電位，提高氧化呼吸率和細胞內ATP水平，促進線粒體再生[11]。維生素PP能增強線粒體的功能，最終抑制細胞衰老[12]。腦組織維生素PP消耗約占全身的70%。煙酰胺核苷對快速老化癡呆小鼠潛在的治療作用提示，線粒體在癡呆發生、發展中具有重要作用。

綜上所述，SAMP8小鼠海馬組織的基因表達模式以神經元保護為主要特征，是一種特殊的細胞線粒體修復模式，其線粒體相關基因表達顯著上調；主要作用靶點是細胞線粒體的維生素PP可能是老年性癡呆的有效治療藥物。