淺談Wnt/β-catenin與腎間質纖維化的關系＊

黃 偉 ，沈金峰 ，謝 娟 ，羅富里 ，晏子友

(1、江西中醫藥大學，南昌 330004；2、江西中醫藥大學附屬醫院，南昌 330006)

腎間質纖維化 （renal interstitial fibrosis，RIF）的形成和發展是一個動態的病理過程，涉及多種細胞因子和信號通路的異常表達調控，如Wnt/βcatenin通路、轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、IGF 及 JAK/STAT 通路、PI3K 通路等[1]。其中以Wnt/β-catenin信號通路的研究較為深入。目前研究證實在腎組織發育中，Wnt/βcatenin信號通路是必需的分子信息傳遞系統，其表達異常與RIF存在相關聯系，且目前尚無特效的治療方法[2]。因此，深入研究Wnt/β－catenin信號通路在RIF形成中的關鍵作用，可為抗RIF的治療提供新的可能途徑及干預靶點。

1 Wnt/β-catenin信號轉導通路概述

1.1 Wnt基因及信號轉導通路 Wnt基因是在發現的wingless基因與int-1基因的基礎上所命名。Wnt信號通路作為生物機體的一個重要信號通路，生理狀態下，它按程序規律地激活和靜止，是誘導生物正常組織分化的信號，參與胚胎進化及組織發育過程中的細胞增殖、極化與凋亡。根據信號轉導的不同方式，可分為兩條途徑：經典Wnt/βcatenin 途徑 (canonicalWnt/β-catenn signal pathway)和非經典的Wnt信號途徑(noncanonical Wnt signal path-way)。

1.2 β-catenin的結構和生物學特性 Wnt/βcatenin信號通路的轉導取決于細胞內β-catenin的水平。β-catenin蛋白在細胞中發揮著雙重作用，在胞膜上與E－鈣粘蛋白(E－cadherin)形成細胞黏附連接復合體(E－cadherin/β－catenin 復合體)，介導同型細胞間的黏附，防止細胞的遷移而發揮作用[3]。 同時 β－catenin 又是 Wnt/β－catenin 信號途徑下游的關鍵效應因子，廣泛存在于各種細胞中，如內皮細胞、成骨細胞、成纖維細胞，并參與了這些細胞的增殖、分化和凋亡等。在正常功能狀態下，βcatenin被磷酸化降解，可使胞質內游離β-catenin濃度保持相對較低水平。此過程中起主要作用的是β-catenin降解復合物，它由Axin、結腸息肉病蛋白(adenomat-osis polyposis coli，APC)、 蛋 白激酶 2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、GSK3、CKI組成，供GSK3黏附，促進β-catenin的磷酸化和降解。當機體受到體內外刺激時Wnt信號活化，可激活其下游因子，導致β-catenin降解減少，在胞質及胞核中聚集，調控Wnt信號通路的下游靶基因轉錄，影響細胞增殖、分化、遷移、凋亡等功能[4]。

1.3 Wnt/β-catenin信號通路核心效應因子 （βcatenin/TCF轉錄復合體）β-catenin入核后與核內轉錄因子T細胞因子TCF結合形成β-catenin/TCF轉錄復合體，實現對Wnt信號通路中下游基因的轉錄調控，進而發揮其生物學效應。在靜息狀態下，核內的TCF/LEF可在WRE序列上結合，并與轉錄抑制因子Groucho和CtBP結合，招募HDAC等一系列因子，抑制下游基因的轉錄，βcatenin入核后可取代Groucho等抑制因子，同時招募一系列轉錄輔助因子，開啟下游基因的轉錄[5]。β-catenin與 Groucho/TLE競爭TCF分子的CRD區域，誘導轉錄抑制因子解離，TCF的轉錄抑制解除可為下一階段轉錄激活做準備[6]。

2 Wnt/β-catenin信號轉導通路與腎間質纖維化

Wnt信號通路在生物進化中具有高度保守性，當Wnt信號通路異常激活，將發生機體纖維化、腫瘤等病理改變。目前研究證實，Wnt/β-catenin通路在RIF的發生發展中發揮著重要作用[7]。上皮細胞-間充質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，ETM)是形成RIF的重要途徑，當發生ETM時，使細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)合成與降解平衡受到破壞，導致ECM在腎間質增多，進而發展至終末期慢性腎臟病。在正常細胞中Wnt信號通路是靜默的[8]，Wnt信號通路在腎小管上皮細胞中處于抑制狀態，且不能調節特定基因的表達。此時絕大部分的β-catenin處于復合體中，與E-cadherin等結合，致腎小管間充質細胞－上皮細胞轉分化(mesenchymal－epithelial transition，MET）的發生[9]。王國勤等[10]采用單側輸尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）小鼠動物模型觀察Wnt7a蛋白拮抗RIF的作用機制時，發現術后7d與模型組相比，治療組腎間質纖維化相對面積顯著減少，α－平滑肌肌動蛋白 （α-smooth muscle actin，α-SMA）及波形蛋白的表達顯著減少，E－鈣粘素表達顯著增多，而β－catenin表達較模型組顯著減少 （P均＜0.05）。表明在 UUO動物模型中Wnt7a蛋白可抑制Wnt/β－catenin通路，抑制腎臟ETM的發生，從而減輕腎臟的纖維化。閔亞麗等[11]觀察Wnt/β-catenin信號通路在腎缺血再灌注(Ischemia reperfusion injury，IRI） 致慢性RIF大鼠模型中的表達發現，IRI組大鼠腎組織β-catenin、Fibronectin、α-SMA蛋白表達水平較假手術組明顯增高，腎功能減退，病理顯示腎小管間質出現纖維化改變。他們還發現IRI術后7d腎臟纖維化尚不明顯時腎組織β-catenin即有增高，在術后14d βcatenin增高更加顯著。提示腎缺血再灌注致腎纖維化過程中Wnt/β-catenin信號通路激活，且早于RIF的出現。表明Wnt/β-catenin信號通路有可能在IRI所致RIF病程中發揮重要作用。葉偉標等[12]通過熒光定量PCR技術發現IgA腎病患者腎活檢組織中miR-155表達水平顯著高于對照組 （P＜0.01），而且miR-155表達量與RIF呈正相關；且通過體外細胞實驗證實，上調miR-155表達可激活Wnt/β-catenin信號通路，增強間質表型標志物fibronectin表達，增加ETM，從而促進RIF的發生。在Wnt/β-catenin信號通路中已有部分靶基因被證實與RIF相關，如纖維連接蛋白(FN)、成纖維特異性蛋白1(Fsp1)、Snaill、基質金屬蛋白酶7(MMP-7)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)等都是通過Wnt/β-catenin信號通路介導的靶基因來對RIF產生影響[13]。林輝等[14]研究發現，當wnt信號通路激活后，活化的β-catenin迅速增多，并由胞質轉向細胞核內，從而激活其下游基因如基質金屬蛋自酶7(MMP7)的表達，而MMP7具有降解ECM的能力，從而抑制RIF的發生發展。

3 Wnt/β-catenin與其他信號通路交叉對話對RIF的影響

3.1 Wnt/β-catenin信號通路表達與 TGF-β/Smad的交叉對話 近年研究發現，Wnt/β-catenin信號通路不僅可以通過對靶基因的直接調控RIF，還可以通過與其他信號通路的交叉對話間接影響RIF。Wnt/β-catenin信號通路與TGF-β/Smad通路的聯系在纖維化中發揮重要作用，現研究表明TGF-β的上調可促進RIF的進展，在TGF-β/smads通路中，TGF-β1與受體結合，活化的TGF-β1受體能夠特異地識別和磷酸化Smad蛋白家庭成員Smad2和Smad3，R-Smads又與其伴侶分子Smad4結合，形成有功能的轉錄復合體，Smad3、Smad4可以與β-atenin和TCF/LEF結合，促進兩信號間相互作用，引起靶基因的轉錄[15]。Wnt/β-catenin信號通過抑制GSK3-β使Smad3處于穩定狀態，磷酸化Smad3的穩定又與高水平的Wnt/β-catenin信號直接相關。TGF-β/Smad信號通路與經典和非經典的Wnt信號通路可通過自分泌和旁分泌共同誘導上皮間質轉化過程，并通過自分泌形式來維持其間質狀態。故TGF-β和Wnt信號通路在成骨細胞、成纖維細胞、多能干細胞的分化及間充質干細胞的狀態維持過程中都發揮極重要作用[16]。

3.2 Wnt/β-catenin信號通路表達與其他信號通路的交叉對話 諸如PI3K/Akt和JNK、周細胞等信號通路與Wnt/β-catenin信號通路之間都存在交聯關系。TGF-β1促進Wnt蛋白的分泌，激活PI3K/Akt，直接磷酸化GSK－3β并抑制其活性，進而激活β-catenin/TCF轉錄復合體以及轉錄因子，促進EMT。Zhang等[17]發現 Wnt11能被 TGF-β 及 Smad3激活，Wnt11的功能由Wnt/JNK通路介導，其通過增強骨髓間充質標記基因活性介導RIF，當受體基因被敲除或受Wnt信號抑制劑干預，能逆轉TGF-β對骨髓間充質標記基的表達。Kawakami等[18]在RIF動物模型中發現，腎周細胞向肌成纖維細胞分化時，Wnt信號通路高度激活，細胞表型發生間充質轉化。周細胞可能向肌成纖維細胞轉化，肌成纖維細胞的活化增殖，導致ECM大量合成，促進RIF的形成，肌成纖維細胞是腎間質中產生ECM最主要的細胞，周細胞是肌成纖維細胞的重要來源[19]。PI3K/Akt和JNK、周細胞信號通路可能是通過與Wnt/β-catenin信號通路的交叉對話實現其生物學效應，Wnt/β-catenin信號通路中存在這些信號通路的激活點，當Wnt/β-catenin信號激活時可同時激活上述信號通路，共同發揮這些通路的生物效應，但這些信號通路究竟與Wnt/β-catenin信號通路哪一節點發揮作用目前尚未完全闡明。

4 干預Wnt/β-catenin信號通路與抗腎間質纖維化

4.1 Wnt/β-catenin信號通路分子靶向抑制劑 近年來針對Wnt/β-catenin信號通路中相關細胞因子為靶點的抑制劑已逐漸成為抗腎臟纖維化治療的新靶點。陳定國等[20]等研究發現DKK-1(Dickkopf-1)蛋白作為Wnt信號通路的抑制因子之一，可通過競爭性結合LRP5/6，也可通過與跨膜蛋自kremen、LRP5/6形成三元復合物而導致快速內吞，減少質膜LRP5/6而抑制Wnt信號通路，抑制肌成纖維細胞的活化及成纖維細胞特異蛋白、纖維連接蛋白的表達，在一定程度上能夠減輕腎臟纖維化程度。陳華等[21]采用UUO小鼠動物模型探討miR-200a對腎Wnt/β-catenin信號通路的影響，結果發現，術后第7d UUO組小鼠腎小管損傷、間質膠原沉積明顯，Wnt4、β-catenin、Fibronectin、α-SMAmRNA 及蛋白表達較假手術組明顯升高（P＜0.05）；而UUO+miR-200a組小鼠腎小管損傷、間質膠原沉積較UUO組明顯減輕，Wnt4、β-catenin、Fibronectin、α-SMA 基因及蛋白表達也較UUO明顯降低（P＜0.05）。表明在UUO模型中Wnt/β-catenin信號通路的激活，可致腎小管損傷，腎間質膠原沉積增多，促進RIF；miR-200a則能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路，緩解RIF，保護殘存腎功能。彭華等[22]采用腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病腎病(DN)大鼠模型發現12周后辛伐他汀治療組大鼠24h尿蛋白定量，血肌酐（Serum creatinine，SCr)、 尿素氮 （Blood urea nitrogen，BUN)顯著降低（P＜0.05）；腎小管間質結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF）、βcatenin的表達明顯下調（P＜0.05），腎組織病理改變明顯減輕。說明辛伐他汀可能通過下調DN大鼠腎小管間質CTGF及β－catenin的表達來保護腎臟功能及延緩RIF。王曼等[23]采用UUO小鼠動物模型，予以丹酚酸 B（salvianolic acid B，SalB）治療，結果發現術后第21d，SalB高、低劑量組小鼠腎臟中膠原Ⅰ型蛋白、α-SMA、TGF-β1的表達水平較模型組均有不同程度的下降（P＜0.01-0.05）；而 SalB高劑量組 E-cadherin 的表達水平則明顯升高（P＜0.01），βcatenin和βp糖原合成激酶3β （glycogen synhase kinase-3，βp-GSK-3β）蛋白表達水平均顯著下降（P均＜0.01），且高劑量組各項指標較低劑量組下降更為明顯。表明SalB可通過下調Wnt/β-catenin通路中的 β-catenin、p-GSK-3β 水平來調控 Wnt/βcatenin信號通路，從而抑制UUO小鼠所致的RIF。

4.2 中醫藥制劑對Wnt/β-catenin信號通路的干預向玉瓊[24]觀察去甲斑蝥素（NCTD）對UUO大鼠及人近端腎小管HK-2纖維化模型Wnt/β-catenin表達的影響，發現假手術組大鼠腎臟β-catenin表達少，隨著UUO大鼠梗阻時間延長，β-catenin蛋白表達逐漸升高，以術后14d表達最強；NCTD治療組大鼠較對照組Wnt4、β-catenin蛋白及mRNA表達明顯下降（P 均＜0.05）；與 TGF-β1 刺激組相比，NCTD 不同濃度干預組Wnt4、β-catenin蛋白表達下調，且呈濃度依賴（P＜0.05）。提示NCTD干預可以下調UUO大鼠腎組織及TGF-β1刺激的HK-2細胞中Wnt4和β-catenin的表達，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮抗RIF作用。付旭等[25]觀察黃芪丹參顆粒藥對UUO大鼠Wnt/β-catenin信號通路的作用機制發現，術后14d模型組大鼠24h尿蛋白和、α1-微球蛋白 （α1-Microglobulin，α1-MG）、 腎組織 Wnt4和β-catenin蛋白表達較正常組均明顯升高（P均＜0.05）；而黃芪丹參顆粒各治療組大鼠24h尿蛋白和、α1-微球蛋白（α1-Microglobulin，α1-MG）、腎組織Wnt4和β-catenin蛋白表達均較模型組明顯降低（P均＜0.05），尤以中、高劑量組更顯著。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號通路參與RIF的發生已經得到大量研究證實，但該信號轉導通路的具體調控方式、與其他信號通路間的相互作用、參與該信號轉導通路的各分子的生理作用以及各靶基因激活的后果和意義均有待進一步研究。隨著對Wnt/β-catenin信號通路及其在RIF發生發展中的作用機制的深入研究，可以以該信號通路為切入點，通過調節Wnt/β-catenin信號通路來干預RIF的過程，為延緩腎功能惡化提供新的思路及治療方向。

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