中醫藥對Dll4-Notch信號通路及血管再生影響的研究*

何志軍，姚興璋，李盛華，趙 萍，蔣振興

甘肅省中醫院/甘肅省隴中正骨醫院，甘肅 蘭州 730050

Notch基因最早在果蠅體內被證實，隨后的研究發現Notch在無脊椎動物到脊椎動物的多個物種內均有表達，包括調控細胞命運，調節細胞遷移、分化和增殖［1］。Dll4-Notch是一條進化保守的信號傳遞途經，由細胞膜上表達的Notch受體、Notch配體及下游信號分子組成。Notch的配體又稱作DSL蛋白，目前已在哺乳動物中發現的5種Notch配體分別稱為Delta like1(DLL1)、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2。Notch信號轉導的啟動依賴于相鄰細胞間受體與配體的相互作用，這種相互作用激活了Notch受體的2次酶切事件［2］。

1 Dll4-Notch信號通路與血管再生

血管再生是指從原有的血管內皮細胞增殖、游走，形成新的血管網，并在原來存在的血管結構上長出新血管的生物學過程。血管再生在組織損傷修復、缺血性心腦血管疾病及腫瘤的發生、發展中具有重要作用。血管再生過程依賴促血管發生因子和抗血管發生因子調控。正常人體內有多種抗血管發生因子，可抑制血管生成；然而，當組織成長和生存依賴血液持續地供給氧氣和營養時，在胚胎發育、女性月經周期、懷孕和傷口修補等過程中，抗血管發生因子減少，促血管發生因子增加，從而誘導血管生成。若血管生成的調控出現問題，可導致各種疾病(包括惡性腫瘤)的發生。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前發現最強的促血管再生的細胞因子，具有促血管內皮細胞增殖和遷移、促血管生成、延長血管內皮細胞壽命、提高血管通透性等生物學作用［3-4］。內皮細胞被劃分為兩類細胞：頂端細胞(Tip cell)和柄細胞(Stalk cell)。血管再生的過程為：1)在特定位置誘導并選擇頂端細胞的形成；2)頂端細胞的絲足沿著促血管生長因子分泌充足的地方遷移；3)柄細胞在血管芽延伸的時候增殖。在哺乳動物細胞中，Notch信號通路在內皮細胞特化為頂端細胞和柄細胞的過程中起到重要調控作用［5］。Notch在柄細胞中的活性很高，而在頂端細胞中呈低水平表達；相反，Dll4在頂端細胞中表達較高。作為血管形成正向調節因子的VEGF，通過誘導VEGFA的表達而啟動Dll4/Notch信號作為負反饋調節因素，有效預防過量血管的形成，從而促進了一個分化良好的血管網能夠根據環境的需要而及時形成。其具體機制為VEGFA通過與VEGFR2結合刺激并誘導內皮頂端細胞表達Dll4，Dll4與鄰近柄細胞內的Notch信號結合，通過下調VEGFR2和VEGFR1上調的表達水平，抑制頂端細胞表型以促進柄細胞特化，使二者之間保持在一個合適的比例以確保血管出芽的精確性［6］。可見，VEGF是Dll4的正向調節因素，而Dll4是VEGF信號的負向調節因素［7］。2006 年，Noguera-Troise等［8］提出了將阻斷Dll4-Notch信號作為治療癌癥的新方法，引起了研究者對于Dll4-Notch信號傳遞系統治療腫瘤的關注。腫瘤的生長以往被認為與腫瘤微血管密度MVD呈正相關，即血管生成越多、腫瘤進展越快，因此，常規抗腫瘤血管生成的治療策略主要是阻止促血管生成因子刺激內皮細胞。近年來，VEGF阻斷劑方面的研究認為，阻斷劑僅能減少腫瘤中“小血管”的數量，對“大血管”無影響。由于“大血管”的形態與功能更完好且管腔較大，能夠為腫瘤傳遞營養和氧氣，增加腫瘤血供，從而改善腫瘤內部的低氧環境并減少壞死區域。而阻斷Notch信號，能破壞“大血管”的形成，加重缺氧程度的同時大幅度上調VEGF的表達水平，能夠提高VEGF阻斷劑療效。相比于單藥治療，同時靶向Dll4和VEGF能產生抗腫瘤協同效應。

2 中醫藥對Notch信號通路影響的研究

目前，中醫藥在抗腫瘤血管生成領域取得了不少成果，但其機制研究仍主要集中在對腫瘤血管生成過程中主要調控因子(如VEGF等)的影響。中藥對Dll4介導的Notch信號通路影響的作用機制研究較少。苗學紅等［9］采用補腎疏肝方治療晚期非小細胞肺癌患者，可縮小病灶，提高機體免疫功能，改善生存質量，其機理為補腎疏肝方誘導A549細胞的凋亡，也可能與抑制Notch1、Delta4、VEGF基因表達有關。劉少瓊等［10］探討了姜黃素抑制大腸癌細胞增殖的分子基礎可能是通過Notch信號通路來實現，認為姜黃素可抑制Notch信號通路中Notch受體和Jagged配體蛋白表達、抑制γ-分泌酶、抑制Notch信號下游的靶基因Skp2及影響與其相關的其他通路，最終達到抑制大腸癌增殖與轉移的目的。有研究［11］認為，養肺活血方能顯著改善肺纖維化大鼠的肺泡炎和肺纖維化程度，有效防治肺纖維化。其作用機制與下調Notch1、NICD1、Notch4、Jagged1、Dll4 的 表 達 有關，提示該方可通過干預Notch信號轉導來防治肺纖維化。楊丹丹等［12］研究認為，血塞通能夠通過促進MSCs表達、抑制VEGF/Notch信號通路改善大鼠心臟功能、減小病理改變程度，促進心肌損傷修復，具有一定的心肌保護作用。作為抗腫瘤血管生成的新靶點，Notch與VEGF信號通路在腫瘤血管生成過程中各自發揮的重要作用好比于“陰陽”兩面，兩者之間相互協調，共同調控腫瘤血管生成。雖然中醫藥對腫瘤血管再生及干預腫瘤增值與轉移方面取得了一些進步，但這大多集中在抑制血管生成方面，而通過介導Dll4-Notch信號通路促進血管生成在顯微外科方面的應用卻未見報道。

3 中醫藥對血管再生影響的研究

除心腦血管領域注重血管再生問題的研究，顯微外科、整形外科同樣重視血管再生。為保證術后修復組織的成活率，很多修復手術完成的質量很高，但組織新生或修復愈后結果并不理想，如復合骨皮瓣修復術后，血循環障礙致皮瓣成活質量低或骨瓣不愈合。這些問題的核心在于如何促進組織血管再生。臨床中很少有人將傳統醫學與顯微外科領域聯系在一起。隨著中醫藥在腦血管、心血管方面研究的不斷深入［13-14］，顯微外科工作者也將傳統醫學的優勢發揮在顯微外科血管再生方面。近年來，單味、復方中藥或其有效成分提取物在顯微外科術后促進神經、血管、骨骼、肌腱、皮膚等組織修復中的應用研究廣泛開展［15］；周昭輝等［16］應用桃紅四物湯對大鼠隨意皮瓣的干預研究發現，桃紅四物湯能明顯促進大鼠隨意皮瓣的成活，提高皮瓣下新生微血管數量，并促進大鼠VEGF的表達。祛瘀生新是中醫學中重要的治法治則，歷代醫學典籍中對這一領域均有詳細論述。但大多集中在理法方藥方面的研究，沒有直觀的理解和解釋。隨著對理論體系的完善，近年來對本領域的研究由功能性的“祛瘀化瘀活血”逐漸過渡到嘗試揭開祛瘀后疾病好轉、治愈的內在原因。“血瘀”的概念逐漸深入到創傷骨科及顯微外科中。中醫外科通過手術祛腐以促進正常組織新生的手段其寶貴經驗中重要的一環就是手術本身就是“祛瘀”的手段之一，其手術的作用就是“祛瘀”，而手術的目的在于更深層次的“生新”。由此可見，祛瘀生新與顯微外科治療理念相符合，旨在促進術后組織的新生。相關研究［17-18］通過建立動物血管修復模型，觀察基于祛瘀生新治則指導下復元活血湯劑對血管、神經顯微外科修復術后各相關組織形態結構、血液生化、相關蛋白或基因表達、生理功能學等各方面指標的影響，從客觀療效方面系統探討祛瘀與“新生血、脈、物”的深層次概念及關系。

消腫止痛合劑為甘肅省中醫院院內制劑。由川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地、當歸、三七、木香、青皮、澤蘭等組成。具有活血化瘀、消腫止痛之功。大量的臨床應用研究認為，消腫止痛合劑可明顯促進創傷后肢體腫脹消退，減輕疼痛、改善靜脈瘀血，減輕炎癥反應［19-21］。有研究報道，在灌服大鼠鼠尾再植模型中發現，消腫止痛合劑能夠使大鼠血清中VEGF含量升高，從而保護血管內皮細胞，利于離斷血管的修復［21］。但這些研究僅僅涉及促血管生成的物質，而并未客觀觀察到血管再生的情況以及基于何種原理來促進血管修復，這仍是今后研究的目標。

因此，能否通過介導Dll4-Notch信號通路促進血管生成，這將是中醫藥在創傷、顯微外科組織修復方面新的研究方向［22-23］，能夠進一步豐富中醫藥理論。