從熱敏通道TRPV1探討蛇床子提取物的作用機制?

安致君，劉珍洪，于 崢，汪文來，陶旭光，高 蔚，郭 蓉，殷 茵， 韓雪珍，吳丹桐，趙凱維， ，趙紅霞Δ，楊 楨Δ

(1. 北京中醫藥大學,北京 100029； 2. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700；3. 美國德克薩斯大學健康科學中心綜合生物學及藥理學系，休斯頓)

蛇床子最早收錄于《神農本草經》，具有數千年的醫療實踐應用，別名野茴香、野胡荽，為傘形科植物蛇床的干燥成熟果實，具有濃郁的芳香氣息。其性味辛、苦、溫，具有溫腎壯陽、殺蟲止癢的功效[1]，臨床上用來治療陰部瘙癢、痹癥、濕疹、陽痿、宮寒不孕等。熱敏通道(TRPV1、TRPA1和TRPM8等)是自然界許多芳香物質的分子靶點，它與溫熱感有關，也與瘙癢和疼痛密切相關。許多辛味中藥如生姜(辛、微溫)、吳茱萸(辛、苦，熱)、蔥白(辛、溫)、羌活(辛、苦，溫)等含有TRPV1的激動劑[2-3]，部分TRPV1/A1/M8的激動劑已經在蛇床子中存在。蛇床子部分藥效的發揮可能是作用于熱敏通道TRPV1路徑實現的。本研究以蛇床子提取物(水提和醇提)為研究對象，結合電生理膜片鉗技術，在瞬轉了人TRPV1的HEK293細胞上測試其能否活化或抑制TRPV1，以探討蛇床子發揮藥效作用的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

中藥蛇床子(北京同仁堂東四藥店)，TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)，質粒GFP(北京愛思益普)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calciumchloride(Sigma)。

1.2 儀器

300克密封型搖擺式粉碎XL-06B(廣州旭朗)、旋轉蒸發器RE-52(上海虹昕)、數顯恒溫水浴鍋HH-6(常州潤華)、SHZIII型循環水真空泵(上海亞榮)、EPC-10 Quattro膜片鉗放大器(Heka)、PatchMaster數據獲取軟件(Heka)、P-97拉制儀器(Sutter Instruments)、IGOR-Pro分析軟件(WaveMetrics Inc)等。

1.3 實驗步驟

1.3.1 蛇床子提取物制備 水提物制備：用電子秤量得50 g蛇床子，倒入400 ml雙蒸水浸泡30 min，加熱至沸騰30 min后倒出藥汁，剩余的藥渣加250 ml雙蒸水第二次煎煮，合并2次藥汁，雙層濾紙過濾，99℃恒溫水浴鍋加熱濃縮調濃度為1 g/ml，3500 r/min離心15 min后取上液即得蛇床子水提物，4℃冰箱中保存備用。

醇提物制備：秤量80 g蛇床子，粉碎后加入640 ml的75%乙醇浸泡30 min，轉移入回流提取器中于95℃恒溫水浴鍋上回流提取2 h，收集藥液過濾，剩余的藥渣再倒入400 ml乙醇繼續回流1 h，2次所提濾液傾入旋轉蒸發器上回收乙醇，所得提取物(膏狀物不含乙醇)用雙蒸水調濃度至1 g(生藥)/ml。以上提取物均分裝后保存于-20℃低溫冰箱備用。

1.3.2 電生理膜片鉗實驗 參照前期實驗論文方法[3]

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 蛇床子水提物作用于hTRPV1/ HEK293效應研究

圖1顯示，蛇床子水提物稀釋成5 mg(生藥)/ml，測試其對表達hTRPV1/ HEK293細胞跨膜電流的作用。實驗過程中，先滴入細胞外液作為陰性對照，觀察電流的基線水平，然后滴加測試樣品，電流到達峰值并開始下降后用細胞外液洗脫(washout)，最后施加陽性藥30 μM辣椒素檢驗所記錄細胞是否成功轉染。結果顯示，與正常細胞外液(Pre)比較，蛇床子水提物使hTRPV1/ HEK293細胞誘導產生明顯的跨膜電流，蛇床子水提物滴加入空轉的HEK293細胞中不產生跨膜電流(數據不顯示)。

注： 左圖：各組+100 mV電壓下電流峰值對比統計圖右圖：+100 mV電壓下跨膜電流時程圖，其中小圖為在細胞外液(a)、蛇床子提取物峰值(b)、辣椒素峰值(c)點用電壓斜坡(voltage ramp)檢測到的I-V關系曲線。**P<0.01，表示組間差異顯著，n=6圖1 蛇床子水提物作用于hTRPV1/ HEK293效應研究

2.2 蛇床子乙醇提取物量效研究

圖2顯示，將蛇床子醇提物給予細胞外液稀釋成3 mg/ml和10 mg/ml，測試這2個濃度的蛇床子醇提物對表達hTRPV1的HEK293細胞跨膜電流的影響。結果顯示，與正常細胞外液(Pre)比較，蛇床子醇提物3 mg/ml、10 mg/ml這2個濃度均可使細胞產生跨膜電流(P<0.01)，且3 mg/ml、10 mg/ml這2個濃度產生的跨膜電流無顯著差異。

注：左圖：各組+100 mV電壓下電流峰值對比統計圖右圖：+100 mV電壓下跨膜電流時程圖** P<0.01，表示組間差異顯著，n=6圖2 蛇床子醇提物對轉染hTRPV1的HEK293細胞全細胞電流影響

2.3 結論

蛇床子的水提物和醇提物都激活TRPV1通道產生跨膜電流。蛇床子的辛溫之性很可能是TRPV1活化的結果，而TRPV1與瘙癢與疼痛的關系可以幫助我們很好地理解蛇床子的相關功效。

3 討論

《神農本草經》將蛇床子列為上品，概述其性味功效：“味苦，平。主婦人陰中腫痛，男子陽痿、濕癢，除痹氣，利關節，癲癇惡創(瘡)。”其后不久的《本草經集注》(草木上品)記載為“味苦、辛、甘，平，無毒。主治婦人陰中腫痛，男子陰痿濕癢，除痹氣，利關節，癲癇，惡瘡。溫中下氣，令婦人子臟熱，男子陰強。”《金匱要略·婦人雜病脈證并治》：“婦人陰寒，溫中坐藥，蛇床子散主之……綿裹內之，自然溫。”《備急千金要方·雜治第十七》曰：“治產后陰下脫方：蛇床子一升，布裹炙熨之。亦治產后陰中痛。”又有外治方：“治男女陰中瘡濕癢方(黃連、梔子、甘草、黃柏、蛇床子)……為細末，以粉瘡上……深者，用綿裹納瘡中。”現代《中藥學》將其應用概括為：“陰部濕癢，濕疹，疥癬；寒濕帶下，濕痹腰痛；腎虛陽痿，宮冷不孕”，既可內服又可外用。現代研究[4-5]顯示，蛇床子具有抗菌、止癢、止痛、防治骨質疏松、保護心血管、抗血栓、鎮靜催眠等作用。

從分子方面理解蛇床子的功效有重要意義。近來，隨著熱敏通道的發現以及部分結構和作用的揭示，使得對蛇床子的部分功效和主治可以得到進一步的理解。熱敏通道是感受寒熱的一類生命攸關的蛋白質，在機械和熱傳導、皮膚穩態、味覺、腎、內分泌、呼吸道、免疫、心血管、中樞神經系統、生育和衰老方面都發揮作用。它們大量的分布在外周感覺神經上，以感知內外環境的溫度、化學、機械等傷害性刺激，與寒熱、疼痛和瘙癢等感覺有著重要關聯[6]。

3.1 蛇床子的化學成分

蛇床子的化學成分主要有香豆素類和揮發油類以及其他微量元素[4]，而具有生物活性的香豆素類化合物含量最高[7]。蛇床子所含歐前胡素(imperatorin)、蛇床子素(osthole)是TRPV1的激動劑[8-9]，其揮發油所含成分檸檬烯能激活另一個熱敏通道TRPA1[10]。

3.2 蛇床子的溫熱感與止痛作用

外周神經調節陰道的平滑肌張力、血流量和疼痛敏感性，而子宮表達TRPV1、TRPA1的神經隨著性激素水平的生理波動，如懷孕、分娩、性周期和青春期時產生巨大改變，局部性激素也參與其間[11-12]。這些部位的疼痛與局部神經重塑有關，外陰痛的特征是在外陰前庭區域有痛苦的燒灼感，異常性疼痛和痛覺過敏，局部上皮內和乳突的神經支配，其間的TRPV1表達大量增加[13]。

蛇床子對外陰和盆腔的疼痛均有良好效果，蛇床子的全身或局部運用會活化TRPV1受體產生溫熱感，這應該是蛇床子外用“綿裹內之，自然溫”的分子基礎，如同辣椒或大蒜。陰道內使用蛇床子除產生溫熱感對宮寒發揮治療作用外，還會由TRPV1/TRPA1介導，通過神經交叉脫敏對多種因素如膀胱炎、前列腺炎、結腸炎或腰肌勞損等引起的盆腔疼痛發揮止痛作用[14]。動物行為學實驗也證明，蛇床子素能夠顯著減少醋酸致痛小鼠的扭體次數和升高熱致痛小鼠的痛閾，對物理和化學引起的疼痛和炎癥均有明顯的對抗作用[4]。

3.3 蛇床子的止癢作用

瘙癢和疼痛是密切相關但截然不同的感覺，其源頭均在感覺神經的皮膚末梢，它們共享大部分重疊的介質和受體，瘙癢反應的神經元對疼痛刺激也很敏感，瘙癢的復雜機制目前并不清楚。疼痛刺激可引起一些慢性病(如特應性皮炎)的瘙癢，一些治療慢性疼痛的藥物對慢性瘙癢也有效，TRPV1的活化對瘙癢通道有抑制作用[15]。實驗證明，適當濃度的蛇床子素可通過調控TRPV1離子通道的活性抑制組胺依賴性癢[8]。

3.4 蛇床子的其他作用

古人用蛇床子治療癲癇。長期以來，認為海馬神經元中的鈣離子累積是癲癇的主要發病因素。TRPV1是海馬中鈣透性通道和癲癇的介質，TRPV1在癲癇腦區如海馬CA1區和齒狀回中表達，表明在海馬體中抑制TRPV1可能是一個預防癲癇發作的靶點[16]。因此，依古籍記載蛇床子可能會作用于大腦，這需要證實其有效成分可以穿過血腦屏障。蛇床子素通過血腦屏障的證據是確定的[17]。蛇床子的抗癲癇作用可能不是以TRPV1為惟一作用靶點，其所含總香豆素可以作用于GABAA受體[18]，該受體在癲癇發作中有重要意義。而這二者之間，TRPV1的活性可以被GABA受體抑制[19]，可能有助于抑制癲癇的發作。可見，蛇床子抗癲癇在同一信號通路中的作用是多靶點的。

蛇床子對神經系統的影響還包括改善學習記憶、抗帕金森、鎮靜催眠等作用[17]，對于蛇床子的研究顯示出有性激素樣作用。性激素在不同的感覺細胞中發揮多效性作用，促進神經系統的再生具有重要的功能。性激素的減少與認知和心理健康受損以及神經病變性疾病的風險增加有關，恢復神經-內分泌軸的關鍵在于老化過程中可通過神經保護和神經再生在部分區域，雌激素依賴性瞬時受體電位陽離子通道TRPV1，能夠介導神經保護、神經生成以及受損神經再生，TRPV1激動劑可調節被敏化神經元的神經保護與修復[20]，而調節劑作為其他認知增強劑，可提高神經干細胞祖細胞在神經網絡中的存活率、分化和整合能力[21]。

精子生成依賴睪丸的酸性微環境，Sertoli細胞為調控和維持精子發生提供了一個受控的微環境，其中酸性環境對男性生育力至關重要。它是由酸敏氯離子通道(ASCC)調節，而TRPV1是其調控因子[21]。精子運動到受精地點是一個復雜過程，這與精子有趨熱性有關，即精子具有溫度導向的運動，這樣才能與卵子結合而受孕。熱敏通道TRPV1是溫度傳感器，是精子趨熱運動的介質[22]。這些研究對蛇床子在陰道的使用、產生溫熱感及治療宮寒不孕有重要意義。

蛇床子性溫味辛，是自然界的香草，有典型的熱敏通道配體的特征。本研究證實了這一點，并部分闡明了該藥的分子意義。