基于網絡藥理學的骨碎補“療傷止痛，補腎強骨”作用機制初探

陳國銘，湯順莉，黃 雁，於菁雯，鄺梓君，林洪榮，趙金龍，劉韻韻， 張培嬋，陳子茵，江曉兵

(1. 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣州 510405； 2. 廣州中醫藥大學第三臨床醫學院， 廣州 510405； 3. 廣州中醫藥大學針灸康復臨床醫學院，廣州 510405； 4. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州 510405)

骨碎補為骨科常用中藥，是水龍骨科(Polypodiaceae)多年生蕨類植物槲蕨Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm.的干燥根莖，始載于《藥性論》，味苦、性溫，歸肝、腎經，具有療傷止痛、補腎強骨之功效，主治跌仆閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動，外用消風祛斑，可治療斑禿、白癜風等[1]。現代藥理表明，骨碎補具有良好的促進骨折愈合、抗骨質疏松、抗炎、促進牙齒生長、防治中毒性耳聾、降血脂等活性。中藥是一個復雜的化學成分體系，其中活性成分通過多靶點、多途徑、多層次的整合調控產生協同功效[2]。因中藥成分復雜，數量龐大，難以深入研究，但中藥網絡藥理學則為此提供了新的思路和視角[3]。網絡藥理學基于“化合物-靶點-疾病”相互作用網絡研究藥物，其研究策略的整體性、系統性特點與中醫學的整體觀念和辨證論治理論不謀而合。因此本課題基于網絡藥理學研究“骨碎補”，以期明確骨碎補中醫療效的作用機制，并進一步深入挖掘骨碎補的其他臨床應用。

1 方法

1.1 骨碎補化合物分子庫的構建

以中藥“骨碎補”為主題詞，從中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)中檢索出骨碎補所有化學成分共142個。考慮到篩選條件應為決定藥物口服利用度以及成藥性優劣的關鍵參數，故采納TCMSP推薦的預測策略，將口服利用度(OB)≥50%和類藥性(DL)≥0.18設定為篩選條件,將數據庫中具有較高活性的化合物篩選出來,最終得到符合條件的化合物共7個。

1.2 化合物-靶標-疾病的藥理學網絡構建

在TCMSP上全面檢索與7個活性化合物相關的潛在靶標，利用Cytoscape 3.5.1軟件將7個候選化合物與其潛在靶標構建成一個體現候選化合物-靶點相互作用的復雜網絡圖，并根據得出的潛在靶點在TCMSP中檢索出相關的疾病，進而可繪制靶點-疾病相互作用復雜網絡圖。

2 結果

2.1 活性化合物篩選結果

圖1 活性化合物結構式

表1圖1顯示，通過數據庫檢索共收集到骨碎補成分化合物142個，設定OB≥50%和DL≥0.18進行篩選，最終得到7個匹配的活性化合物，其中4個黃酮類化合物，2個苷類化合物，1個酯類化合物。篩選出的化合物均同時具有較高的OB和DL值，如MOL005190(OB=71.79%，DL=0.24)、MOL009078(OB=62.65%，DL=0.51)，目前已有不少文獻報道黃酮類化合物治療骨質疏松癥確有一定療效，如其中柚皮素通過調控CTSK、Wnt/β-catenin 等信號通路發揮作用[4-5]。OB、DL和degree值排名第一的3個活性分子分別為eriodictyol(圣草苷)、davallioside A_qt(骨碎補苷A_qt)和naringenin(柚皮素)。

表1 通過OB-DL值預測篩選出骨碎補有效成分信息

2.2 有效化合物—潛在靶標的作用網絡分析

本研究中，筆者將經過 OB 和 DL 篩選的 7個活性化合物及其潛在的靶標相連來構建分子-靶點相互作用網絡。活性化合物-潛在靶標相互作用網絡包含62個節點(6 個化合物和 56個潛在靶標) 和 73條邊，另化合物MOL009087(marioside_qt)因在數據處理過程中發現，其在該數據庫中還未有相關的靶點，故而在構建候選化合物-潛在靶標網絡中，只顯示相關的6個化合物。在網絡圖中，紅色節點代表候選化合物，黃色和灰色節點表示藥物靶標，而每條邊則表示候選化合物分子與靶標間的相互作用關系。在網絡中，一個節點(node)的度值(degree)表示網絡中和節點相連的路線條數，每一個化合物的度值即表示候選化合物分子所擁有的靶點數目; 而每一個靶點的度值則代表著相應靶點所有相關活性化合物分子的數目。

圖2顯示，通過對分子-靶點相互作用復雜網絡節點的度值進行統計和排列，將網絡圖重構成分子-靶點排序網絡圖，并使用分層染色使其一目了然。通過排序網絡圖可以發現，參與網絡構建的化合物作用的不同通路以及頻次高低，通過分析通路和頻次，可以估測和評價候選化合物在藥物起效機制中的作用。圖中各節點面積大小與其度值成正比，面積越大表明其能作用于更多的其他節點。黃色節點代表能夠被2個或2個以上骨碎補活性化合物作用的人體靶點，灰色節點代表只被一個骨碎補活性成分作用的孤立靶點。

圖2 骨碎補活性化合物與其靶標相互作用網絡

圖2顯示，面積最大的節點是骨碎補活性分子MOL004328(naringenin)，擁有最多的潛在靶標(37 個)，其次是MOL000492((+)-catechin)，有11個潛在靶標，MOL001978(Aureusidin)有9個潛在靶標。這些度值高的藥物分子有可能在骨碎補藥理功能中發揮較為重要的作用。在56個潛在靶標中，有9個靶標至少與2個化合物分子連接。圖2顯示，紅色節點正是通過這9個靶標(黃色節點)間接相連，提示中藥各成分之間很可能是通過此種方式起協同作用。有47個靶標只與 1 個候選化合物分子相關。利用Cytoscape自帶的強大網絡分析工具(Network Analyzer)對骨碎補活性化合物-靶標相互作用網絡進行無向性(Undirected)拓撲學分析表明，網絡中每個候選化合物都至少與3個潛在靶標連接，網絡的中介中心度為0.587，共有3787條最短通路，典型通路長度2.952，平均度值2.355，網絡異質性2.058，說明骨碎補中含有的候選化合物分子可能作用于整個生物網絡系統，而不單一作用于某一個潛在靶標，從而更進一步說明中草藥作用的整體性與復雜性。在7個化合物中，度值最高為naringenin即柚皮素(37)，其為黃酮類化合物，具有抗骨質疏松作用，可通過影響破骨相關基因表達抑制破骨細胞成熟和分化[6]。OB 值最高的為eriodictyol即圣草酚(OB=71.79%)，其為黃酮類成分，具有較強的抗氧化、抗炎、鎮痛、改善糖尿病及糖尿病并發癥的作用[7]，主要通過CTSK、Wnt/β-catenin 等信號通道起效。DL 最高的davallioside A_qt 即骨碎補苷A(DL=0.51)，但目前關于此化合物的研究甚少，為以后的研究提供了方向。現將這3個化學成分具體介紹如下。

2.2.1 柚皮素(Naringenin) 柚皮素作為柚皮苷的主要代謝產物，是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類化合物。國內外藥理研究表明，柚皮素具有抗菌消炎、抗氧化、抗癌抗腫瘤、抗損傷、降血脂等多種藥理活性[8]。以往骨碎補活性單體成分調控骨質疏松實驗的干預措施多為柚皮苷，但近年來不少動物實驗研究結果表明，柚皮素同樣具有明顯的抗骨質疏松作用。如宋雙紅[9]、翟遠坤等[10]的研究表明，柚皮素具有明顯的促骨形成活性，能夠促進成骨相關基因表達，保持骨密度。更有Pang，W Y等[11]體外實驗進一步探究表明，柚皮素對成骨細胞促骨形成活性要優于柚皮苷。吳新濤等[12]研究發現，柚皮素可能通過上調 Bcl-2 表達、下調 Bax、 Caspase-3 表達等機制對氧化應激誘導的成骨細胞凋亡具有拮抗作用，同時柚皮素通過影響破骨細胞特異性基因TRAP、MMP-9、CATK、OPG/RANKL/RANK的表達，能夠明顯抑制破骨細胞分化和成熟，促使骨組織向成骨方向發展，這揭示了柚皮素作用于骨質疏松癥的可能機制。

2.2.2 圣草苷(eriodictyol) 圣草苷是骨碎補中另一個主要的黃酮類活性成分。作為自由基受體及鏈終止劑的黃酮類化合物具有抗氧化活性，其抗氧化能力大小與羥基位置及羥化程度有重要關系。抗氧化活性最強的是B環上有鄰二酚羥基的黃酮[13]。由圣草苷的結構式(見圖1)可知，圣草苷正是B環上具有鄰二酚羥基的黃酮，據此可以推測圣草苷是一種潛在的抗氧化活性很強的天然抗氧化劑。目前研究表明，圣草酚具有抗炎、抗氧化、鎮痛、改善糖尿病及糖尿病并發癥的作用[7]。Song，F等[14]觀察到，Eriodictyol能夠通過抑制NFATc1活性和RANKL誘導NF-kB、MAPK、Ca2+信號通路來阻止RANKL誘導破骨細胞的形成。Li、L等[15]通過RT-PCR發現，圣草苷可以上調成骨分化過程中Runx2、COLI和BGP 3個標志性基因的表達，此外圣草苷還可在一定程度上逆轉PD98059對細胞分化的抑制，起到抗骨質疏松的作用。因此，圣草苷防治骨質疏松癥和其他骨相關疾病的應用前景廣闊。

2.2.3 骨碎補苷A_qt(davallioside A_qt) 目前對該化合物的研究較少，本研究通過分析化合物-靶點-疾病網絡發現其較多的作用于凝血因子，與多種心血管疾病相關，可以作為未來實驗探究的一個方向。

2.3 潛在靶標—相關疾病的作用網絡分析

圖3為根據潛在靶標與相關疾病構建而成的網絡圖。該網絡圖中有56個靶標和131種相關疾病共187個節點(紅色為靶點，白色為相關疾病)，節點大小與其自身度值成正比。在TCMSP上發現，活性化合物所涉及的靶點數目有 56個，而在靶標-疾病網絡中只顯示34個相應靶點蛋白，由此可知，有22個靶標在網絡中沒有相對應的疾病，由此可推測骨碎補可能還存在尚未被發現的臨床應用價值，提示可為之后全面挖掘骨碎補臨床應用提供突破方向，發現其可用于治療的更多疾病。表2為潛在靶標對應相關疾病和骨碎補成分的度值，可以看出一個靶蛋白可以與許多疾病相關。靶標與疾病度值前三位依次為前列腺素G/H合酶2、DNA拓撲異構酶II、熱休克蛋白HSP 90。前列腺素G/H合酶2也稱環氧合酶(COX-2)，是前列腺素類物質合成的關鍵酶，它在動脈粥樣硬化、血管成形術后狹窄等血管炎性疾病的發展中扮演著重要角色[16]。前列腺素G / H合酶2的潛在靶標度值最高為39，可見其治療疾病范圍最為廣闊，提示可能為骨碎補藥效機制的主要靶標。李洋[17]等研究表明，BMP9在誘導干細胞成骨分化過程中激活PI3K/Akt信號，可能與其促進COX-2表達有關,且COX-2抑制劑具有明顯延遲骨折愈合的不良反應。COX2的表達水平以及其引起的PG分泌，會影響軟骨細胞形成和軟骨內化骨，從而促進成骨細胞活性和骨形成。度值為22的DNA拓撲異構酶IIα，是DNA代謝過程中重要核酶，目前已成為許多抗癌藥物的作用靶點。熱休克蛋白HSP90是在生物體中廣泛存在的一種保守蛋白，其在生物體受到外界脅迫時起到分子伴侶作用，現代研究驗證，其具有延長細胞壽命、抑制細胞凋亡的作用。郭曉華等[18]研究發現，HSP90與eNOS 結合增加NO合成釋放，可舒張血管，改善腎缺血，另外還有參與腫瘤免疫[19]、調控腫瘤生長和轉移的作用[20]。Siebelt，M等[21]研究表明，軟骨細胞應激誘導的Hsp90合成在骨關節炎(OA)發病中起重要作用。劇烈運動引起的生物力學應力往往會增加大鼠關節軟骨中的Hsp90蛋白水平。Hsp90抑制和隨后增加的Hsp70水平，使軟骨細胞通過將糖胺聚糖(sGAG)量增加到基線以上來維持軟骨體內平衡，保護細胞外基質在身體活動期間增加生物力學影響。Hsp90抑制進一步改善軟骨下骨厚度并減少滑膜巨噬細胞活化，說明HSP90抑制可潛在地保護或改善軟骨健康，并可能阻止OA的發展。HSP的缺失也可導致神經退行性疾病[22]。此外，高度值的靶標還有前列腺素G/H合酶1、Calmodulin、Coagulation factor Xa等，涉及的通路與疾病十分廣泛，由此可知潛在靶標可作用于機體各個系統，包括心血管、內分泌、神經、生殖等系統，通過查閱相關現代藥理學研究文獻可充分驗證該觀點。

圖3 骨碎補活性化合物靶標與相關疾病相互作用網絡

序號與化合物度值(degree)潛在靶標(Target)名稱與疾病度值(degree)15Prostaglandin G/H synthase 2(前列腺素G / H合酶2)3921DNA topoisomerase II(DNA拓撲異構酶II)2235Heat shock protein HSP 90(熱休克蛋白HSP 90)2243Prostaglandin G/H synthase 12051Calmodulin1761Coagulation factor Xa1673mRNA of PKA Catalytic Subunit C-al-pha1482Nuclear receptor coactivator 21493Estrogen receptor10102Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit, gamma iso-form8111Nitric oxide synthase, inducible7121Androgen receptor6131Caspase-36142Beta-lactamase5151Retinoic acid receptor RXR-alpha5162Peroxisome proliferator activated re-ceptor gamma4171Glycogen synthase kinase-3 beta4181RAC-alpha serine/threonine-protein kinase4191Apoptosis regulator Bcl-24201Carbonic anhydrase II3211Estrogen receptor beta3221Mitogen-activated protein kinase 143231Transcription factor p653241Glutathione S-transferase P3251Hyaluronan synthase 23261Heme oxygenase 13

表3 潛在標靶相關疾病(degree≥3)出現頻次比較

3 討論

歷代文獻對骨碎補均有記載，如《藥性論》：“主骨中毒氣，風血疼痛，五勞六極，口手不收，上熱下冷。”《本草圖經》：“治閃折筋骨損傷”“又用治耳聾”“亦入婦人血氣藥用”。《本草綱目》：“治耳鳴及腎虛久泄、牙痛。”由此可見，中醫對藥物治療疾病的認識具有整體觀，而基于大數據“多成分-多靶點”的網絡藥理學正好打破了以往藥理學研究單一成分單一靶標的缺點，是從整體認識和探究中藥復雜成分治病機制的有力手段[23]。

現代《藥典》認為，骨碎補具有“療傷止痛、補腎強骨”的功效。本次研究從骨碎補142個成分中篩選出7個具有高口服利用度和高類藥性的活性成分，相應的有56個靶點和131種疾病，揭示了中醫“異病同治”的物質基礎。研究表明，度值最高的成分柚皮素具有促進骨細胞形成、抗骨質疏松的作用，口服利用度最高的成分圣草酚具有抗炎、抗骨質疏松的作用，這與中醫所講“止痛、強骨”有密切聯系。其重要靶標亦被證實，與調節骨代謝和抗氧化相關，主要涉及癌癥、炎癥性疾病、神經退行性病變、骨質疏松、阿爾茨海默癥、腦損傷等疾病。中醫認為“腎主骨、骨生髓、腦為髓之海”，因此骨碎補“補腎”的功效可能與治療上述疾病相關。另外，從網絡中也能夠發現一些尚待深入研究的方向。

綜上所述，在大數據急速發展的生物信息時代，運用網絡藥理學研究中藥符合中醫所提倡的“整體觀”，該方法具有很大的潛力，值得探索。其研究結果具有一定的參考價值和提示作用，若要進一步運用于指導臨床，則需相關基礎和臨床實驗進行驗證。