瀉肺湯通過Bcl-2/Bax表達調控肺纖維化大鼠自由基代謝的實驗研究?

安方玉，顏春魯，劉永琦，駱亞莉，劉雪松，李 楊，史旭鋒，張 雪

(1. 甘肅中醫藥大學，蘭州 730000； 2. 甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，蘭州 730000； 3. 敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，蘭州 730000)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性炎癥性間質性肺疾病，病理特征主要以彌漫性肺泡炎、肺泡結構紊亂、肺纖維化為主[1]，由于其機制未明而導致臨床治療效果欠佳，故探索肺纖維化的發病機制和尋找合適的治療藥物是目前研究的熱點。本課題組前期研究發現，瀉肺湯通過降低肺纖維化模型大鼠血清羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量和肺組織一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，抑制肺組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性而顯示出較好的抗肺纖維化效果[2]。為此，本實驗采用博來霉素氣管內滴注法建立大鼠肺纖維化模型，通過觀察瀉肺湯對肺纖維化模型大鼠血清TGF-β1、TNF-α 含量和肺組織Bcl-2/Bax表達的影響，揭示其治療機制，為抗IPF 藥物的研發提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠84只，體質量(180-220)g，雌雄各半，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心提供(實驗動物質量合格證編號SCXK(甘)2011-0002-0002141)。

1.2 實驗藥物及給藥劑量

醋酸潑尼松片(江蘇鵬鶴藥業有限公司生產，批號1404273)按照臨床用量換算配成0. 2 mg /mL混懸液。敦煌古醫方瀉肺湯中的葶藶子、生地黃、生大黃、竹葉、甘草5 味藥(購自甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，批號分別為140303、140115、140418、140209、131112)按照臨床用量換算配成1、2、4 g /mL水煎劑。博來霉素(日本化藥株式會社， 批號415A025)用生理鹽水配成5 mg /kg 藥液備用。

1.3 試劑與儀器

一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20140805、20140820)；Rat TGF-β1precocated ELISA kit 和Rat TNF-α precocated ELISA kit檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號20140801)；Bcl-2和Bax抗體(IMMNUWAY 公司)；Trizol Reagent 試劑(美國，批號471220)；反轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒(Promega，批號分別為0000079124 和0000114842)；iMark型全自動酶標分析儀(美國Bio-Rad公司)；T6新悅-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Molecular Imager ChemiDocTM XRS+With Image LabTM Software(BIO-RAD)；S1000TM Thermal Cycler(BIO-RAD)；7500 Real Time PCR System(英濰捷基(上海)貿易有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

SPF 級SD大鼠飲食、飲水5 d后，按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、瀉肺湯水煎劑低、中、高劑量組、陽性對照組每組14只。正常對照組除外，各組大鼠用10% 水合氯醛麻醉固定后，采用Szapiel 法[3]氣管內注射博來霉素(5 mL/kg) 復制肺纖維化模型，正常對照組氣管內注射等體積生理鹽水。術后第2天，灌胃給藥，瀉肺湯低、中、高劑量為10、20、40 g/kg，陽性對照組(醋酸潑尼松)劑量為1. 8 mg/kg。正常對照組及模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續28 d。次日檢測各組大鼠的肺功能后，股動脈釆血處死大鼠，左肺進行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液分離血清摘取右肺備用。

2.2 清醒狀態下無創肺功能測定

末次給藥后次日開啟動物肺功能測定儀，將大鼠放入特定描記箱中，每次4 只，在大鼠無創和清醒狀態下描記吸氣時間(inspiratory time，TI)、呼氣時間(expiratory time，TE)、潮氣量(tidal volume，TV)和肺泡通氣量(alveolar ventilation，AV)等，測試完畢后保存結果并整理數據。

2.3 肺泡灌洗液中NO含量和NOS活性測定

剖胸、結扎右主支氣管，用14號針頭刺入氣管并行結扎，往氣管注入用生理鹽水2～3 mL，反復沖洗3～4次，收集沖洗液即肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fliud，BALF)約 4～6 mL，離心收集上清液8～10 min，比色分析法測定其上清液中NO含量和NOS活性。具體操作按照試劑說明書嚴格執行。

2.4 血清TNF-α和TGF-β1含量測定

股動脈采血，常規方法制備血清備用。ELISA法測定轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.5 肺組織bax和bcl-2基因表達測定

Trizol Reagent提取肺組織總RNA，測定RNA含量和260/280的比值。反轉錄合成 cDNA進行 PCR 擴增(熒光定量法)，擴增條件為：95℃預變性2 min， 95℃變性15 s，58℃退火45 s，60℃延伸1 min，35～40個循環。每樣品重復3次，數據以 2-△△Ct表示樣本中目的基因相對表達含量。其中，β-actin、bax 和bcl-2等引物均由 TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司設計并合成。其基因序列如下： bax上游引物：5’-gCAAAgTAgAAAAgggCgACA-3’，size：21，下游引物：5’-gACgAACTggACAgTAACATggA-3’，size：23；bcl-2上游引物：5’-AgAgTCTTCAgAgAACAgCCAggAg-3’，size：24，下游引物：5’- AACATCgCCCTgTggATgAC-3’，size：20；β-actin上游引物：5’-TggCACCCAgCACAATgAA-3’，size：19， 下游引物：5’-CTAAgTCATAgTCCgCCTAgAAgCA-3’，size:25。

2.6 肺組織Bax和Bcl-2蛋白表達測定

用預冷的組織蛋白裂解液(RPMI∶PMSF=1∶100)提取肺組織總蛋白，測定蛋白含量后調整蛋白濃度為50 μg/10 μL，每孔點樣 10 μL。電泳、轉膜、封閉，加一抗(山羊抗大鼠 Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH 抗體)，4℃孵育過夜。洗膜后將膜置于山羊抗兔辣根酶標記的二抗中，室溫孵育2 h后，洗膜后加入ECL化學發光液顯影，Bio-Rad 凝膠成像儀采集信號并攝取凝膠圖像。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 瀉肺湯對肺纖維化大鼠肺功能的影響

表1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠TE、TV和AV等肺功能指標均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，瀉肺湯各干預組大鼠TV和AV等肺功能指標顯著升高，瀉肺湯高劑量組大鼠TE肺功能指標顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表 1 各組動物清醒無創狀態下肺功能指標變化比較

注：與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

3.2 瀉肺湯對肺纖維化大鼠NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGF-β1含量的影響

表2顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGF-β1含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，瀉肺湯中、高劑量組和陽性對照組大鼠NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGF-β1含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組動物NOS活性、NO含量、TNF-α含量和TGFβ1含量的檢測結果

注：與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

3.3 瀉肺湯對肺纖維化大鼠bax、bcl-2基因表達和蛋白表達的影響

表3圖1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織bax基因表達和蛋白表達明顯升高，bcl-2基因表達和蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，瀉肺湯中、高劑量組和陽性對照組大鼠肺組織bax基因表達和蛋白表達均明顯降低，bcl-2基因表達和蛋白表達均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

表3 各組動物肺組織bax和bcl-2基因表達和蛋白表達結果

注：與正常對照組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

Western-blot圖1 各組動物肺肌組織Bax、Bcl-2蛋白表達

4 討論

特發性肺纖維化屬于中醫學“肺痿”“肺脹”等范疇，病機涉及虛、瘀、濁等方面，因此治法以“益氣養陰、活血化瘀、清熱祛瘀”為主。

瀉肺湯源自《輔行訣臟腑用藥法要》，由葶藶子、大黃、生地黃、竹葉、甘草5味中藥組成。方中葶藶子消痰平喘、利水消腫，大黃活血化瘀，生地黃養血潤燥，竹葉清解解毒，甘草益氣和中，瀉肺湯可能對肺纖維化具有治療作用。本課題組前期實驗已證實，瀉肺湯通過降低NO和Hyp 的含量，抑制NOS的活性達到防治肺組織纖維化目的[2]。

目前肺纖維化發病的確切機制未明，但有研究已證實[4-6]，肺纖維化發病過程中涉及氧化應激損傷、炎癥因子表達異常、細胞凋亡信號通路失常。

氧化應激損傷、細胞因子及其網絡的作用和細胞凋亡，一直是肺纖維化發生發展的關鍵因素。NOS是催化L-精氨酸產生NO的關鍵酶，生成的產物NO有擴張肺血管、減少白細胞和血小板聚集等作用[7]。研究發現，TNF-α通過刺激TGF-β、IL-6等細胞因子的產生而促進成纖維細胞的增殖，也可以通過提高TGF-β的產生促進上皮間質轉化，還可以通過增加TGF-β1mRNA的穩定性和轉錄促進TGF-β1的表達[8-10]。TGF -β1表達上調是產生肺、肝、腎等纖維化疾病的關鍵步驟，其參與機體胚胎發育、腫瘤生長分化、細胞增殖凋亡、纖維組織的修復和調節免疫反應等各種生物過程[11-14]。而Bcl-2和Bax則是調控細胞凋亡的關鍵蛋白[15]，Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax是促進細胞凋亡[16]。因此，Bcl- 2的表達升高和Bax的表達降低有利于細胞的存活。有研究也證實，肺纖維化鼠Bcl-2基因及蛋白表達均下調[17-19]，因此在尋求治療肺纖維化藥物的研究中，增強機體的抗氧化能力，減弱機體的氧化能力，調控機體氧化/抗氧化之間的平衡，抑制TNF-α 和TGF-β1的生物制劑，已成為衡量肺纖維化療效的標準之一。本實驗結果顯示，瀉肺湯能不同程度地降低模型大鼠體內NOS的活性及NO、TGF-β1和TNF-α含量，升高Bcl-2的基因及蛋白表達，降低Bax的基因及蛋白表達來發揮治療作用。

綜上所述，瀉肺湯對博萊霉素所致大鼠肺纖維化具有防治作用，其可能的機制是瀉肺湯通過上調Bcl-2的表達、降低Bax的表達和致纖維化細胞因子TGF-β1與TNF-α的含量來達到調節肺纖維化氧化應激損傷的的目的，從而實現其保護作用。