丹參通脈方對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響及其機(jī)制研究?

魏 群，曹 珊

(河南中醫(yī)藥大學(xué)， 鄭州 450046)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個(gè)多因素共同參與的過(guò)程，可導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生。隨著年齡的增加，AS逐漸加重，目前已確定其與血栓形成、血管壁脂質(zhì)浸潤(rùn)、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和黏附分子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1]。研究顯示，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可誘導(dǎo)血管VSMC增殖及遷移，VSMC的異常增生與遷移是AS發(fā)生過(guò)程中重要的病理基礎(chǔ)[2]。我院自研的丹參通脈方(丹參、川芎、葛根、三七)具有調(diào)節(jié)血脂、降低血清Hcy水平的作用[3]。本研究探討丹參通脈方 Hcy誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響，旨在分析其作用機(jī)制，更好地為臨床應(yīng)用服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不限，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK 20090001)。

1.2 藥物及試劑

丹參通脈方為我院自制方，由丹參10 g、川芎5 g、葛根10 g、三七6 g組成，經(jīng)100 ml水煮，殘液旋轉(zhuǎn)蒸、凍干后得到。丹參、川芎、葛根、三七均經(jīng)我院鑒定。Hcy為Sigma公司產(chǎn)品(批號(hào)C-7352)； DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為四季青公司產(chǎn)品(批號(hào)20160315)；蛋白提取試劑盒為上海哈靈生物公司產(chǎn)品(批號(hào)20160205)；4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)為sigma公司產(chǎn)品(批號(hào)D8200)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純劑試劑。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；精密電子天平(梅特勒-托利多)；電動(dòng)移液器(德國(guó)Eppendorff公司)；Western電泳儀(美國(guó)伯樂(lè))；Western轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)伯樂(lè))；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 公司)；CytomicsTMFC 500系列流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特)；Transwell小室(Chemicon公司)；轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Red公司)。

1.4 VSMC原代細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定[2]

采用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMC，采用平滑肌肌動(dòng)蛋白(SM-actin)免疫熒光鑒定 VSMC，并通過(guò)SM-actin與4’、 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染關(guān)系檢測(cè)VSMC純度，培養(yǎng)4～7 代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 分組與給藥

培養(yǎng)4～7 代的VSMC原代細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/L，于24孔板加入細(xì)胞懸浮液，每孔細(xì)胞5×104個(gè)，細(xì)胞分為對(duì)照組、Hcy組(500 μmol/L Hcy)、丹參通脈方低劑量組(500 μmol/L Hcy+1 mg/L丹參通脈方凍干粉)、丹參通脈方高劑量組(500 μmol/L Hcy+10 mg/L丹參通脈方凍干粉)和瑞舒伐他汀組(500 μmol/L Hcy+1 mg/L瑞舒伐他汀)5組。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，至70%～80%細(xì)胞融合后各組相應(yīng)加入藥物。對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組，分別培養(yǎng)48 h。PBS沖洗培養(yǎng)板，隨后加入MTT再培養(yǎng)4～5 h，棄上清加150 uL DMSO 溶解，于酶標(biāo)分析儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度值，所得數(shù)值為各組值減去空白對(duì)照值，采用劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移面積。

1.7 Transwell法檢測(cè)VSMC遷移

取將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化后各組相應(yīng)加入藥物，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。各組24孔板配套的Transwell 小室下室加入10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基500 μL，上室加入200 μL 細(xì)胞懸液，分別培養(yǎng)4、8、12、24、48 h。結(jié)束后取下Transwell半透膜，PBS洗滌3 次，多聚甲醛固定，DAPI 染核后熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.8 Western-blotting檢測(cè)NF-κB、CHOP和TRB3蛋白表達(dá)水平

將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育，至70%～80%細(xì)胞融合后各組相應(yīng)加入藥物，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)48 h。裂解VSMC提取總蛋白，Bradford法測(cè)定樣品的蛋白含量，12%的凝膠分離蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))在100 V 1.5 h的條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與稀釋的NF-κB、CHOP和TRB3單克隆抗體(1∶1 000)過(guò)夜結(jié)合，洗模后加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，BeyoECL Plus顯色，凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運(yùn)用 Quantity One 軟件進(jìn)行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 VSMC原代培養(yǎng)及鑒定細(xì)胞圖

圖1顯示，大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs培養(yǎng)7 d 后組織塊周?chē)屑?xì)胞爬出，細(xì)胞融合傳代后呈典型“峰谷”狀排列生長(zhǎng)，SM-actin細(xì)胞免疫熒光鑒定VSMC細(xì)胞純度>99%。

注：左：形態(tài)學(xué)觀察(×100)；右：細(xì)胞免疫熒光鑒定(×200)圖1 VSMC原代培養(yǎng)及鑒定細(xì)胞圖

2.2 各組細(xì)胞吸光度值測(cè)定結(jié)果

圖2顯示，與對(duì)照組比較，Hcy組細(xì)胞 24、48 h OD值顯著上升(P<0.05)；與Hcy組比較，丹參通脈方低劑量組、丹參通脈方高劑量組和瑞舒伐他汀組24、48 h OD值顯著下降(P<0.05)，且丹參通脈方高劑量組顯著低于丹參通脈方低劑量組(P<0.05)。

圖2 各組細(xì)胞吸光度值測(cè)定結(jié)果

2.3 各組細(xì)胞遷移情況比較

表1顯示，與對(duì)照組比較，Hcy組細(xì)胞遷移面積和穿透細(xì)胞數(shù)量顯著上升(P<0.05)；與Hcy組比較，丹參通脈方低劑量組、丹參通脈方高劑量組和瑞舒伐他汀組遷移面積和穿透細(xì)胞數(shù)量顯著下降(P<0.05)，且丹參通脈方高劑量組顯著低于丹參通脈方低劑量組(P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞遷移比較

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與Hcy組比較：▲P<0.05；與丹參通脈方低劑量組比較：△P<0.05

2.4 各組NF-κB、CHOP和TRB3表達(dá)比較

表1顯示，與對(duì)照組比較，Hcy組NF-κB、CHOP和TRB3表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；與Hcy組比較，丹參通脈方低劑量組、丹參通脈方高劑量組和瑞舒伐他汀組NF-κB、CHOP和TRB3表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，且丹參通脈方高劑量組顯著低于丹參通脈方低劑量組(P<0.05)。

表2 各組NF-κB、CHOP和TRB3表達(dá)情況比較

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與Hcy組比較：▲P<0.05；與丹參通脈方低劑量組比較：△P<0.05

注：a：丹參通脈方低劑量組；b： Hcy組；c：丹參通脈方高劑量組；d：對(duì)照組；e：瑞舒伐他汀組圖3 Western-blotting檢測(cè)NF-κB、CHOP和TRB3表達(dá)水平

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)及其所導(dǎo)致的心腦血管疾病是當(dāng)今人類(lèi)死亡的首位原因。目前已確定與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的因素主要包括血管壁脂質(zhì)浸潤(rùn)、血栓形成、損傷后的生物連鎖反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC) 克隆增殖以及各種黏附分子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等，但其確切的病因至今尚未完全闡明。 因此，AS發(fā)生機(jī)制及治療靶點(diǎn)已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。眾多研究表明，Hcy可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoPlasmic reticulum stress, ERS)介導(dǎo)內(nèi)VSMC損傷和凋亡，從而啟動(dòng)血栓形成，促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展[4-6]。此外，Hcy還可通過(guò)活化NF-κB途徑上調(diào)VSMC內(nèi)組織因子的表達(dá)水平，促進(jìn)VSMC增殖，并促進(jìn)VSMC表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化[4-10]。因此，本研究中采用Hcy作為通過(guò)ERS/NF-κB網(wǎng)絡(luò)通路誘導(dǎo)VSMC損傷和增殖的刺激因子。

丹參通脈方以活血化瘀、通脈止痛組方，方中包含丹參、川芎、葛根、三七等專走血分的藥物，具有養(yǎng)血活血的作用。因此，目前臨床中多將丹參通脈方用于對(duì)高血壓并腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、血瘀型下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥、動(dòng)脈粥樣硬化和血栓閉塞性脈管炎等疾病的治療，并取得了較佳的臨床療效。

VSMC位于動(dòng)脈血管的中層，具有多種功能，根據(jù)其功能不同分為收縮型和合成型2種表型。在正常情況下處于非增生狀態(tài)、內(nèi)表面有完整的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋即為收縮型。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，血液中的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞分裂因子通過(guò)平滑肌細(xì)胞表面的受體，激活細(xì)胞內(nèi)與表型有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)變成合成型并移行至內(nèi)膜迅速增生。而內(nèi)膜的大量增生將形成肌源性泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化的重要病理學(xué)特征之一，因此抑制平滑肌細(xì)胞增殖是心血管疾病防治的重要手段。MTT和Transwell試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Hcy可誘導(dǎo)VSMC的增殖和遷移，丹參通脈方具有抑制VSMC增殖和遷移的作用，且呈劑量依賴方式。VSMC位于動(dòng)脈血管的中層，具有多種生物學(xué)功能，其主要功能是收縮血管，但當(dāng)血管發(fā)生炎癥反應(yīng)激活細(xì)胞有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，VSMC可被激活、增殖和遷移能力增加[11]，因此丹參通脈方具有抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移作用。董宜旋等[12]報(bào)道稱，中藥丹參主要有效成分丹參酮ⅡA，可以抑制由Hcy誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移。我們的前期研究顯示，由丹參、川芎、葛根、三七組成的丹參通脈方在冠心病、腦動(dòng)脈粥樣硬化、腦血栓治療方面效果顯著，具有調(diào)節(jié)血脂、降低血HCY水平、抗AS等作用。陳芳等[13]報(bào)道稱，丹參通脈方可有效干預(yù)頸動(dòng)脈AS斑塊的發(fā)生發(fā)展，具有較好的防治AS作用。既往研究證實(shí)，葛根素具有調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)VSMC、拮抗高Hcy誘導(dǎo)VSMC異常增殖等良好的抗AS作用[14-16]。

VSMC的增殖和遷移受多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控，以往研究多集中于單個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行研究。由于AS發(fā)生是多基因互動(dòng)的結(jié)果，因此本研究中以ERS/NF-κB 2條密切相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)通路綜合調(diào)控為主線，對(duì)丹參通脈方抗AS分子機(jī)制進(jìn)行分析。NF-κB信號(hào)通路的異常激活與AS疾病的發(fā)生密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在AS病灶中的巨噬細(xì)胞、VSMC等多種細(xì)胞中NF-κB多度活化[17-18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是重要的細(xì)胞器之一，是蛋白質(zhì)合成、加工和運(yùn)輸?shù)闹饕獔?chǎng)所，同時(shí)在類(lèi)固醇激素合成和脂質(zhì)代謝過(guò)程中具有重要作用。在多種因素刺激下，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[19-23]。長(zhǎng)期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典的標(biāo)志物之一，其表達(dá)上調(diào)則激活細(xì)胞死亡途徑，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡加重腦損傷[14]。TRB3蛋白是一種激酶類(lèi)似蛋白，可與絲/蘇氨酸蛋白激酶AKT結(jié)合，從而參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，CHOP表達(dá)上調(diào)促進(jìn)TRB3基因的表達(dá)[24-27]。因此，丹參通脈方可能是通過(guò)ERS/NF-κB發(fā)揮抑制Hcy誘導(dǎo)VSMC增殖和遷移的作用。