香煙煙霧誘導氣道上皮細胞DNA損傷反應研究

徐志偉，石林惠，李桃紅，董縐縐

作者單位： 315040寧波，寧波市醫療中心李惠利東部醫院

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種氣流受限不完全可逆且呈進行性發展的肺部疾病。根據WHO統計，到2020年全球 COPD的死亡率將升至第3位。COPD的發生與多種因素有關，如吸煙、職業性粉塵及化學物質（蒸汽、刺激物、煙塵）等，其中吸煙是最常見也是最危險的因素，90%的COPD患者都是吸煙者[1]。香煙接觸后即使離開香煙煙霧環境，但氣道慢性炎癥仍進行性發展，此過程推測可能與香煙煙霧誘導 DNA損傷有關[2]。H2AX參與DNA雙鏈斷裂（DSB）的識別和修復。本研究擬通過細胞水平探討香煙煙霧提取物（CSE）誘導人氣道上皮（HBE）細胞的DNA損傷，導致基因組不穩定，從而揭示慢性氣道炎癥性疾病的可能發病機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 人正常氣道HBE（上海中國科學院細胞庫），香煙為專供研究所用的無任何添加劑的香煙（焦油量10mg，煙氣煙堿1mg），DMEM細胞培養液（美國Hyclone公司），DMSO（美國Sigma公司），IL-6放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術研究所）。按Nakamura等[3]方法，將2支去過濾嘴香煙于一個注射器驅動裝置連續抽吸而燃著，吸入的煙霧經三通另一個出口通入50 ml無血清培養液中制成懸液。懸液用1mol/LNaOH調至pH值為7.4，經0.22 m微孔濾膜過濾備用。制備的CSE凍存于－40℃冰箱，解凍后在30 min之內用于實驗。

1.2 細胞培養及CSE干預 含10%FBS的1640培養基培養HBE細胞，細胞放置于37℃含5%CO2的恒溫培養箱中，隔天換液，待細胞生長融合至80%～90%時，用胰蛋白消化傳代或計數后種板實驗。取生長狀態良好的細胞用于實驗。接種細胞密度為1×106個/ml，接種于6孔板中，在細胞融合率達到70%時，棄掉培養基，加入1.0%CSE、2.0%CSE、3.0%CSE、4.0%CSE分別干預HBE細胞，同時設立對照，4h后收集細胞培養上清液，結果最少重復3次。離心，存入－80℃冰箱，統一ELISA測量IL-6表達水平。

1.3 克隆形成實驗 用1.0%CSE、2.0%CSE、3.0%CSE干預HBE細胞4 h后，將生長融合至85%左右的細胞消化，制成懸液，反復吹打成單個細胞，將細胞懸液作梯度倍數稀釋，以每皿200個細胞的梯度密度接種10 cm培養皿中，輕輕轉動，使細胞分散均勻，置細胞培養箱中培養2～3周，隔天觀察細胞克隆形成情況，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄去上清液，用PBS輕輕浸洗2次，4%多聚甲酸固定細胞15 min，去除固定液，滴加Wright-Giemsa覆蓋培養皿底部，室溫染色2min；滴加等量磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動，使磷酸鹽緩沖液、Wright-Giemsa混勻，室溫靜置8 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥；將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，計數克隆數；克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.4 ELISA檢測上清液細胞因子表達水平 對照組、1.0%CSE、2.0%CSE、4.0%CSE細胞培養上清液統一 ELISA測量IL-6表達水平。

1.5 細胞免疫熒光 經1.0%CSE、2.0%CSE、4.0%CSE干預HBE細胞及對照組HBE細胞，用PBS洗滌后，4%多聚甲醛進行固定。PBS洗滌后用0.3%Triton X 100室溫通透。再經PBS洗滌，5%BSA室溫固定1 h。隨后用鼠抗人 H2AX單克隆抗體（1∶500稀釋)，4℃過夜。PBS洗滌3次，用Alexa Flour 488/594標記的羊抗鼠(1∶1 000稀釋)于37℃溫育1 h。洗滌后，DAPI室溫染色 10 min，中性樹脂封片后可于熒光顯微鏡下拍照觀察。實驗重復3次。

1.6 統計方法 采用SPSS17.0及Prism5.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 克隆形成實驗 發現經1.0%CSE干預后 HBE細胞的克隆形成率為（58.1±11.1）%，2.0%CSE的克隆形成率為（28.4±7.2）%，3.0%CSE的克隆形成率為（10.2±4.5）%，4.0%CSE的克隆形成率為（12.8±5.3）%，各組克隆形成率差異有統計學意義（F=255.3，P＜ 0.05）。

2.2 不同濃度CSE干預細胞后IL-6表達情況 對照組IL-6表達（9.26±5.38）pg/ml，1.0%CSE組IL-6 表達（8.26±3.90）pg/ml，2.0%CSE組IL-6 表達（20.82±5.83）pg/ml，4.0%CSE組IL-6 表達（57.70±14.39）pg/ml，各組IL-6表達差異有統計學意義（F=58.66，P＜0.05）；與對照組相比，干預組上清液IL-6的表達明顯升高（P＜0.05），除1.0%CSE組與對照組差異無統計學意義（P=0.216），2.0%CSE組、4.0%CSE組與對照組差異均有統計學意義（P=0.012、0.006）。

2.3 不同干預方式下HBE細胞DNA損傷表達情況 通過免疫熒光技術檢測H2AX焦點的數量和大小可反應細胞DNA損傷的情況。HBE細胞經1.0%、2.0%、4.0%CSE干預4 h后，免疫熒光染色結果顯示，H2AX表達陽性細胞數分別為（9.26±5.38）%、（20.82±5.83）%及（57.06±14.38）%，差異有統計學意義（F=60.14，P＜0.05），提示HBE細胞DNA損傷反應隨CSE濃度增加而增加。封四彩圖3。

3 討論

吸煙是COPD主要發病危險因素[4]，部分吸煙 COPD患者在戒煙后氣流受限仍進行性發展，氣道中慢性炎癥持續存在，并對激素表現不敏感[5]。有學者推測是機體對香煙煙霧產生免疫反應，導致氣道上皮細胞產生DNA損傷，啟動氣道慢性炎癥反應[6]。本研究通過體外實驗探討香煙煙霧誘導氣道上皮細胞DNA損傷反應。

細胞克隆實驗發現HBE細胞經CSE干預后細胞增殖能力明顯減弱，不同濃度CSE干預HBE細胞，上清提取液行Elisa檢測顯示炎性因子IL-6表達水平隨CSE濃度增高而增高，提示CSE對支氣管上皮細胞造成炎性損傷。IL-6不僅具有促炎和免疫調節的作用，還具有炎癥放大作用，參與疾病的發生發展過程以及機體的炎癥反應和免疫應答。DNA雙鏈斷裂（DSBs）是由于多種內源性或外源性物質如活性氧、電離輻射及化學藥物等導致，機體對此具備一定的修復能力。發生DSBs時，組蛋白H2AX的C末端139位絲氨酸發生磷酸化，與斷裂位點呈相應的數量關系，因此，H2AX是目前檢測DSBs的“金標準”[7]。本研究通過免疫熒光法檢測發現CSE誘導HBE細胞 H2AX陽性表達，且隨CSE干預濃度增高，HBE中 H2AX陽性表達數也隨之增高。

通過上述實驗可初步解釋吸煙導致氣道慢性炎癥持續存在的可能機制，即CSE可能通過IL-6擴大炎癥反應，誘導DNA損傷，并影響HBE細胞基因組穩定性及其增殖活力，進而導致慢性氣道炎癥的持續進展。