急性白血病病人WT1 mRNA表達及臨床意義

(株洲市中心醫院，湖南 株洲 412007 1 血液科實驗室； 2 血液科)

腎母細胞瘤基因1(WT1)基因最早于1990年由CALL從兒童腎母細胞瘤中分離并鑒定出來[1]，定位于人染色體11p13。研究證實其編碼的鋅指蛋白具有轉錄激活和抑制雙重功能，在調控細胞的生長和分化中發揮著重要作用[2]。本研究通過對我院初治急性白血病(AL)病人治療各階段骨髓中WT1 mRNA表達水平檢測，進一步探討其表達水平與病人病程及預后關系?，F將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月—2016年12月于我院就診的初診為AL病人65例，其中男40例，女25例；平均年齡(51.3±18.5)歲。所有病人均經骨髓細胞學、流式免疫分型、染色體以及融合基因檢測確診，按照FAB標準進行分型：急性淋巴細胞白血病(ALL)8例，急性髓系白血病(AML)54例(其中M2 22例，M3 14例，M5 18例)，急性混合細胞性白血病(AMLL)1例，骨髓增生異常綜合征急變M2 1例，慢性粒細胞白血病急變M2 1例。同期選擇健康志愿者10例和再生障礙性貧血10例作為對照組。初診AL病人及治療各階段所取標本均為骨髓標本，對照組中健康志愿者為外周血標本，再生障礙性貧血為骨髓標本。

1.2 儀器與試劑

紅細胞裂解液(天根生化科技有限公司)，WT1 mRNA檢測試劑盒(上海源奇生物醫藥科技有限公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 研究方法

1.3.1細胞總RNA的提取 取EDTA抗凝的病人骨髓或外周血適量，加入2倍體積的紅細胞裂解液與之混勻，置4 ℃冰箱10 min(紅細胞破裂，呈紅色透明狀)，后以5 000 r/min離心2～4 min，棄上清液保留沉淀(可再清洗1次)，在沉淀中加入適量DEPC-H2O，制成細胞懸液。取100 μL細胞懸液，加入3倍體積Trizol，徹底混勻，采用Trizol法提取細胞總RNA，4 ℃保存RQ-PCR待用。

1.3.2WT1 mRNA表達的檢測 采用RQ-PCR一步法檢測病人骨髓或外周血中WT1 mRNA的表達，以ABL為內參基因。目的基因(或內參基因)反應體系：目的基因(或內參基因)反應液8 μL+酶液2 μL+RNA 15 μL，總體積為25 μL。反應條件為：42 ℃ 30 min；94 ℃預變性5 min；然后94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進行40個循環。獲得擴增曲線，得到WT1基因及ABL基因檢測濃度。WT1 mRNA相對表達量=(WT1基因檢測濃度/ABL基因檢測濃度)×100%。以骨髓中WT1 mRNA的相對表達量>0.55%為陽性，外周血中WT1 mRNA相對表達量>0為陽性。

2 結 果

2.1 對照組及AL組WT1 mRNA的表達

65例AL病人51例骨髓中WT1 mRNA表達陽性，陽性表達率為78.5%；其中8例ALL病人中5例表達陽性,陽性表達率為62.5%；56例AML病人中45例表達陽性，陽性表達率為80.4%，該基因在ALL及AML骨髓中表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。1例AMLL病人骨髓中WT1 mRNA相對表達量為272.3%。對照組骨髓和外周血中均未檢測到WT1 mRNA的表達。AML中M2、M3、M5亞型病人骨髓中WT1 mRNA相對表達量中位數分別為50.65%、162.2%、39.29%，初診AL病人各亞型間(排除AMLL)骨髓中WT1 mRNA相對表達量差異有顯著性(χ2=433.878,P<0.01)；M2、M5亞型病人WT1 mRNA的相對表達量均明顯低于M3亞型病人(Z=-15.266、-19.147,P<0.01)；M2亞型病人WT1 mRNA相對表達量明顯高于M5亞型病人(Z=-4.518,P<0.01)。

2.2 WT1 mRNA表達與病人預后的關系

經標準方案化療后，隨訪觀察12個月，排除死亡及脫訪者，動態監測53例AL病人WT1 mRNA的表達，其中40例達到CR，5例NR，8例復發，其中4例WT1 mRNA已轉陰的病人在臨床提示CR時WT1 mRNA轉為陽性，而此時血常規及形態學均提示CR，比形態學確認的臨床復發提前了平均(68±18.67)d。根據病人的療效，將其分為初診組、復發組、NR組、CR組。初診組、復發組、NR組、CR組WT1 mRNA相對表達量中位數分別為34.5%、59.4%、79.6%、0。初診組、復發組、NR組WT1 mRNA的相對表達量均顯著高于CR組，差異有顯著性(Z=-6.089～-5.450，P<0.01)；初診組、復發組與NR組WT1 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

初診時WT1 mRNA陽性的39例病人中獲得完全緩解26例，復發8例，CR率為66.67%，復發率為20.5%，WT1 mRNA陰性的14例病人中獲得完全緩解14例，CR率為100%，復發率為0，兩者CR率比較差異有統計學意義(P=0.012)，兩者復發率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

大量研究表明，WT1基因是抑癌基因，同時又發揮癌基因樣作用，在血液系統惡性疾病中起非常重要的作用[3-4]。本研究發現，WT1 mRNA在AL的骨髓中有較高表達，在正常人的骨髓或外周血中未檢測到其表達，與文獻報道的在白血病細胞中高表達，在正常成熟細胞中無表達或者極微量表達一致[5-6]，說明WT1基因與AL的發生發展有關，可能參與了白血病細胞的分化[7-8]。本研究結果顯示，ALL、AML病人骨髓中WT1 mRNA表達陽性率分別為62.5% 和80.4%，兩組陽性率比較差異無統計學意義，這與國內外相關研究結果一致[5,9-10]。在AML各亞型中，M3組WT1 mRNA相對表達水平最高，其次是M2，再次是M5，這也與相關文獻報道的結果一致[11-12]。國內外學者研究結果[3,5-6]和本研究結果均證明 WT1 mRNA 在AL中過表達，且具有較高的陽性率，提示WT1 mRNA檢測可具有更廣泛的臨床應用價值，尤其是對于無特異分子學標記的AL。

本研究跟蹤隨訪53例AL病人，對其不同轉歸進行分組，比較他們之間的WT1 mRNA表達水平，初診組、復發組、NR組病人的WT1 mRNA表達水平顯著高于CR組。提示WT1 mRNA的表達水平可作為評估疾病療效、預測疾病轉歸的有效指標之一，特別是對于無特異性基因標志的白血病病人。有學者分析AML病人WT1 mRNA的表達，結果顯示WT1高表達組治療后1年CR率低于WT1低表達組，而兩組復發率比較差異無顯著性[13-14]，這與本研究結果基本一致。而陸麗娜等[15]對AML病人預后研究顯示，WT1增高組比WT1正常組復發率更高，差異有統計學意義，但是與本研究結果有一定差異，可能與治療方案及疾病結構組成不同有關。

AL是血液系統常見的惡性腫瘤之一，目前隨著治療方法和藥物的更新，緩解率已經得到了很大提高，但是白血病易復發仍是治療中難以攻克的難題，微小殘留病灶(MRD)是導致復發的直接原因，與病人預后密切相關，動態監測MRD能有助于監測治療效果以及早期預測血液學復發情況[16-18]。本研究動態觀察WT1 mRNA不同疾病階段的表達，結果顯示初診WT1 mRNA陽性表達病人隨著治療的好轉 WT1 mRNA 表達水平逐漸下降直至轉陰，WT1 mRNA已轉陰的病人隨著病情的復發 WT1 mRNA可轉陽，并且可早于臨床指標提示的復發，WT1 mRNA表達陽性且未達到CR的病人WT1 mRNA表達持續陽性，WT1 mRNA 陽性表達組具有更低的緩解率。提示 WT1 mRNA可作為評估治療效果、判斷預后、預測復發及MRD監測的臨床指標之一。這與國內相關研究結果一致[19-20]，與國外學者認為WT1可以作為一種新的泛白血病基因用于MRD的監測以及預測復發的結論也是一致的[18,21]。

綜上所述，應用RQ-PCR一步法可以高效快速地檢測AL病人WT1 mRNA表達水平，具有重要的臨床價值，對AL病人疾病的進展、療效的監測、判斷預后、預測復發及MRD的監測均有重要意義，尤其是對于無特異性分子學標志物的白血病，為臨床個體化精準治療提供更可靠的依據。