miR-370靶向作用TRAF-4對肺癌細胞增殖和凋亡的影響

張曦，陳文俊，黃選章，吳聰聰，林瑞芳，吳劍

肺癌是我國最為高發的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌占肺癌的 80%～90%，患者確診后多為中晚期，而造成80%以上非小細胞肺癌患者死亡的原因是發生遠處轉移[1]。微小RNA（miRNA）是由內源性基因編碼的單鏈非編碼RNA分子，在細胞內發揮重要的調節功能，在人體的不同組織中miRNAs的表達水平存在顯著差異[2]。miR-370是一種最早于人體胚胎干細胞中被克隆出的miRNA，目前發現其在多種惡性腫瘤中存在表達，參與了對腫瘤發生和進展的調控作用[3]，但其在非小細胞肺癌中的研究目前鮮有報道。本研究通過檢測非小細胞肺癌組織和細胞系中miR-370的表達水平，研究其對非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用靶點，為研究非小細胞肺癌發生發展的分子機制提供理論參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2015年 9月至2016年11月來溫州醫科大學附屬第二醫院就診的非小細胞肺癌患者58例，其中男 37例，女 21例；平均年齡（48.2±4.1）歲；術前均未進行任何腫瘤相關治療。取非小細胞肺癌組織和正常肺上皮組織新鮮標本，標本均經組織病理學確診。肺癌細胞A549、SPC-A1、H460、GLC082和 PC-9及正常肺上皮細胞EBAS-2B均購自于中國醫學科學院基礎醫學研究所。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測miR-370的表達采用總RNA提取試劑盒（日本Takara公司）提取新鮮肺組織和肺癌細胞株中總RNA，反轉錄方法合成cDNA，并采取熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司）進行PCR反應，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。PCR反應條件為95 ℃預變性 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃10 s，一共進行40個循環。所有反應設3個重復。RT-PCR 分析采用 2－△△Ct法，△Ct為目的基因與內參基因的CT值比較后再將實驗組與空白對照組進行比較，即△△Ct=△CtmiR-370－△CtGAPDH。

1.2.2 CCK-8法檢測miR-370對肺癌細胞增殖的影響 將肺癌細胞A549分為3組，分別轉染 miR-370 mimics（miR-370模擬物組）、miR-370 inhibitor（miR-370抑制劑組）及無關序列（空白對照組），用胰酶將細胞消化5 min，按104個/孔將細胞接種于96孔板中，并置于37℃、5%的二氧化碳培養箱中進行培養 4 h。取不同時間點（24、48、72、96 h）采用CCK-8法對肺癌細胞A549的增殖能力進行檢測，每組細胞設3個復孔并重復3次實驗。

1.2.3 流式細胞術檢測肺癌細胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化肺癌細胞，將消化好的細胞進行離心10 min，離心條件為500 r/min，4℃；取出離心管后棄上清，加入標記緩沖液懸浮細胞；往細胞液中加入Annexin V-FITC（南京凱基生物公司），置于室溫孵育15 min，避光。采用流式細胞儀檢測肺癌細胞A549的細胞凋亡情況，每組重復3次。

1.2.4 雙熒光素酶檢測 將處于對數生長期的肺癌細胞 A549接種于96孔板中，每孔體積為100 l，置于二氧化碳培養箱進行孵育24 h，按照Lipofectamin 2000（美國Invitrogen公司）說明書進行細胞轉染。48 h后取出細胞并更換培養基，震蕩10 min后進行雙熒光素酶實驗，采用熒光計測定熒光值。

1.2.5 Western blot檢測腫瘤壞死因子受體相關基因4（TRAF-4）蛋白的表達提取肺癌細胞株總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取50 g蛋白進行 SDSPAGE電泳，電泳后濕轉移至PVDF膜，并放置封閉液中封閉1h，加TRAF-4兔抗人單克隆抗體（1∶1000），4℃孵育過夜，加入羊抗鼠二抗（1∶5 000），置于室溫下搖床孵育1 h，采取ECL化學發光法顯色。采用Image J圖像處理軟件進行圖像分析，以TRAF-4/-tubulin灰度比值作為TRAF-4的相對表達水平。

1.3 統計方法 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，采用 檢驗或方差分析。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-370在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達 非小細胞肺癌組織中miR-370的平均相對表達量為（0.366±0.039），而癌旁正常組織中為（1.049±0.171），兩組差異有統計學意義（t=12.948，P=0.001）。在非小細胞肺癌細胞 A549、SPC-A1、H460、GLC082和PC-9中，miR-370的相對表達量分別為（0.497±0.123）、（0.551±0.161）、（0.513±0.136）、（0.461±0.126） 及（0.378±0.061），與正常肺上皮細胞差異均有統計意義（t≥16.148，均P＜0.05）。

2.2 miR-370對肺癌細胞A594細胞生長的影響 miR-370在轉染了 miR-370 inhibitor后表達顯著降低，而在轉染miR-370mimics后顯著升高，見封二彩圖6。轉染第4天后，miR-370mimic肺癌細胞A549的活力顯著低于空白對照組，轉染 miR-370 inhibitor的細胞生長活力顯著升高，與對照組和空白組差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見封二彩圖7。

2.3 MiR-370對肺癌細胞凋亡的影響轉染miR-370 mimics 72 h后，肺癌細胞A549的凋亡率從39.0%提高到76.1%，而miR-370 inhibitor組細胞的凋亡率則為 18.0%，顯著低于空白對照組（=0.000）。見封三彩圖1。

2.4 雙熒光素酶報告基因檢測TRAF-4 mRNA 3'-UTR與miR-370有互補結合位點，且得分最高。miR-370mimics與野生型 TRAF-4共轉染組的細胞熒光素酶活性顯著下降（P=0.004），而突變型共轉染組熒光素酶活性則無明顯變化。同時在miR-370 inhibitor組和空白對照組中未觀察到熒光素酶活性變化，差異無統計學意義（P=0.112），見封三彩圖2。

2.5 miR-370對TRAF-4蛋白表達的影響 細胞轉染24 h后，轉染 miR-370 mimics后TRAF-4蛋白的相對表達量為（0.31±0.05），而 miR-370 inhibitor組的TRAF-4相對表達量為（2.38±0.33），兩組差異有統計學意義（t=3.286，P=0.012）。

3 討論

miR-370是近年來發現在多種腫瘤中發揮調控作用的小分子RNA。研究表明，miRNA與非小細胞肺癌的發生、發展和遷移過程存在緊密聯系[4]。陳小平[5]發現，miR-370在乳腺癌組織中表達水平是癌旁正常組織的近6倍，且其表達與患者腫瘤大小、臨床分期及浸潤程度呈正相關。Lo等[6]發現，miR-370在人胃癌組織中表達顯著上調，且其可直接靶向作用于FoxM1基因，上調miR-370水平可促進胃癌細胞的增殖和侵襲能力。韓玲[7]發現，miR-370在非小細胞肺癌中的表達與細胞的黏附和轉移密切相關，沉默miR-370的表達可顯著升高肺癌細胞侵襲和轉移，且可提高肺癌患者的生存率。TRAF-4是TRAF家族中一員，其主要參與腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的信號傳導[8]。目前多項研究發現，TRAF-4在乳腺癌、肺癌和結直腸癌中高表達，通過基因載體的方式抑制TRAF-4的表達可降低腫瘤細胞的生長、侵襲和遷移能力[9-10]。Wu等[11]采用慢病毒感染的方式對結直腸癌細胞中TRAF-4的表達進行沉默，可抑制結直腸癌細胞SW620的增殖，同時對Akt的活化過程也有較強的抑制作用。Zhang等[12]在肺癌細胞中過表達TRAF-4，可發現肺癌細胞增殖能力顯著增強，同時可增加S期細胞比例。

本研究結果顯示，在非小細胞肺癌組織和肺癌細胞系中，miR-370表達均顯著下調（均＜0.05），表明miR-370在非小細胞肺癌的發生發展過程中可能充當了抑癌基因的功能。在對肺癌細胞A549進行細胞轉染后，可觀察到miR-370mimics組在第3天開始生長速度顯著降低，在第4天其生長速度顯著低于空白組，表明miR-370可抑制肺癌細胞的增殖能力；流式細胞檢測結果表明，空白對照組、miR-370 mimics組和miR-370 inhibitor組的細胞凋亡率分別為 39.0%、76.1%和18.0%，miR-370mimics組細胞凋亡率顯著高于抑制劑組和空白組（均＜ 0.05），表明 miR-370對肺癌細胞的凋亡具有促進作用。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示miR-370可直接靶向作用與TRAF-4蛋白，同時，Western blotting結果顯示，miR-370mimics組肺癌細胞中TRAF-4的表達量顯著低于空白組，而抑制miR-370的表達后，肺癌細胞A549中TRAF-4的表達則顯著上調，這說明miR-370對肺癌細胞中TRAF-4的表達具有抑制作用。

綜上所述，miR-370在非小細胞肺癌組織和細胞中低表達，過表達miR-370可抑制非小細胞肺癌細胞的生長，并促進細胞凋亡。因此，miR-370表達的顯著下調對于非小細胞肺癌的診斷提供一定參考，同時也可能成為肺癌治療的靶向分子之一。