喬木樹種植物組織培養問題研究

肖 巍

（遼寧省固沙造林研究所，遼寧阜新 123000）

近幾十年，植物組織培養技術不斷成熟并迅速發展，應用領域和范圍不斷擴大。特別是在林木育種中，面對生態環境的惡化、林木種苗需求的增大、珍稀樹種的擴繁等問題，植物組織培養可以利用其外植體用量少、繁殖速度快等特點對林木樹種進行快速繁殖。但是，在離體培養及試管苗生根等方面，存在初接種污染高、離體培養物褐化、退化嚴重、增殖系數低等問題一直未能得到有效解決[1-3]。尤其是高大的喬木樹種，還面臨著污染率高、褐化率高等問題。因此，現以核桃楸植物組織為例，總結歸納植物組織培養中常見問題，以供參考。

1 污染問題

在植物組織培養中，普遍存在材料、接種和培養過程三類污染。

1.1 材料污染 植物組織培養因外植體材料帶來的污染很常見，原因主要是外植體種類、取材時間和外植體消毒處理方式選擇不當。

1.1.1 外植體種類 外植體的生長狀態很重要，會嚴重影響組培苗的生長。所以，要采集生長健壯、無明顯病蟲害的外植體材料。不同的植物器官在組織培養過程中難易程度有一定差異，常用的植物組織器官有葉片、莖段、未成熟胚。

1.1.2 外植體的取材時間 植物組織培養應選用當年萌發幼嫩的外植體，取材時間一般集中在3-5月。相比于其他時間段，3-5月的外植體萌發率高且污染率低。植條應在連續3個晴天后采集，采集當天天氣晴朗，因降雨情況下采集會增大外植體在組織培養當中的污染率。一天中的采集時間也很重要，應選擇陽光充足的時間段，利用紫外線可殺死外植體表面的部分細菌，以達到降低污染率的目的，所以一般選擇11：00-15：00為宜。

1.1.3 外植體的消毒處理 保證組培苗在無菌條件下生長，是植物組織培養成功的關鍵因素之一，所以對于外植體的消毒試劑和消毒時間選擇很重要。在林木育種組織培養時，常用的消毒試劑有次氯酸鈉和酒精配合升汞使用。例如，在組培核桃楸時，酒精配合升汞消毒效果比次氯酸鈉配合升汞更好。消毒時間的選擇也很重要，消毒時間過長會影響外植體生長，消毒時間過短往往達不到最佳消毒效果。

1.2 接種污染 接種培養過程中的污染，主要是由操作環境、操作工具和操作人員造成的。

1.2.1 操作環境造成的污染 植物組織培養時，無菌環境非常重要。在操作之前，要對無菌室和操作臺進行酒精和紫外線消毒，以防止試驗材料被污染。

1.2.2 操作工具造成的污染 在試驗操作過程中，由于操作工具直接接觸外植體，因此在試驗中操作工具的消毒尤為重要。對于試驗中用到的工具能夠高壓滅菌的，要放入高壓滅菌鍋內進行滅菌，其他工具要進行酒精和紫外線殺菌。

1.2.3 操作人員造成的污染 人員進入組培室前，要穿上已經消毒的白外套。操作過程中，先用酒精棉對雙手消毒，然后嚴格按照流程要求操作，避免說話。

1.3 培養過程污染 培養瓶應在接種之后放置于培養室中。培養瓶中的外植體在室溫環境下進行呼吸作用，通過培養瓶蓋上的濾膜進行氣體交換。培養環境不清潔，空氣濕度過高，培養室內污染苗過多，都會造成外植體污染。因此，要定期對培養室進行消毒，非實驗人員不得隨意進入培養室，保證培養室清潔，以防對試驗材料造成污染。

2 褐化問題

組織培養過程中，核桃等木本植物的外植體褐變比較明顯。接種后的外植體和培養基均會褐變，褐化會抑制外植體的生長甚至死亡。一般可通過選擇適宜外植體、添加褐變抑制劑及吸附劑、外植體預處理、選擇最佳培養基和培養條件來解決。

2.1 選擇適宜的外植體 木本植物組織培養的首選材料是幼嫩新生的外植體，如腋生枝上的頂芽，因其分生能力較強，比其他部位頂芽的褐變率低。

2.2 添加褐變抑制劑和吸附劑 由于褐化是由多酚物質氧化造成，可以通過在培養基中添加抑制劑，抑制外植體褐化。常用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）和抗壞血酸（VC），添加到培養基中可在一定程度上抑制外植體褐化，結合聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭等吸附劑的添加，可吸附褐化過程中產生的氧化產物，進一步減免對外植體的傷害。

2.3 外植體的預處理 對于易褐變的外植體材料進行預處理，可以減輕醌類物質對培養物的毒害作用。將易褐化的外植體放置在5 ℃左右的冰箱中低溫處理12～24 h，再將外植體消毒后接種到只含有蔗糖和瓊脂的培養基中，使褐化物質吸附到培養基中，再更換培養基，直至無明顯褐化。

2.4 選擇適宜的培養基和培養條件 因無機鹽和激素水平可影響褐變發生，所以應提前通過反復試驗來篩選降低褐化的最佳培養基。因強光會提高多酚氧化酶（PPO）活性，促進多酚類物質氧化，所以剛剛接種的外植體應在黑暗或弱光下進行初期培養。總之，選擇適宜的培養基和培養條件均可降低褐化率。

3 結語

由于受到林業和樹木本身生物學特性的限制，植物組織培養在林木樹種中的研究稍滯后于生物學科的其他領域。通過組織培養能達到實用目的樹種仍僅局限于桉、楊等少數樹種，很多樹種的組織培養存在污染率高、褐化難以控制、增殖系數低、難以生根等問題。

該文從試驗中總結了一些林木樹種中常見問題和解決對策。針對污染問題，可以選擇幼嫩當年萌發的外植體，嚴格把關操作細節，嚴格控制外植體的培養環境。針對褐化問題，可選擇適宜的培養基和激素濃度來抑制褐化，在培養基中添加抗褐化抑制劑與吸附劑，加大培養基的更換頻率，可一定程度地減少褐化給外植體帶來的危害。

組織培養技術在林木樹中的應用還有很多技術難題亟待解決，尤其是針葉樹的組織培養，這些問題的研究有待深入研究，使組培技術更加成熟和完善，能夠得到更加廣泛的應用，產生更大的生態效益、社會效益和經濟效益。

[1]張小紅，代侃韌，馬兆平，等.核桃離體培養中外植體褐化的研究[J].陜西林業科技，2005（4）：7-9.

[2]張建成，張曉偉.核桃試管苗生根培養的研究[J].河北林果研究，2005（4）：361-365.

[3]張俊林，劉慶忠，劉松，等.核桃莖尖培養中防止褐變的方法[J].北京農學院學報，2007（2）：17-19.