西北民族大學榆中校區8種草本科植物根際產功能酶放線菌的篩選

車敏娜，吳 恒，武中庸，熱孜萬古力·賽買提，王國威，鄭棱峻，陳士恩

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730124)

包括蛋白酶、淀粉酶、脂酶等在內的功能酶在生命科學、醫學科學領域以及食品、飼料添加劑、化工等行業具有潛在的應用價值。工業生產一般是在特殊的物理化學條件下進行的，而在這個過程中起重要作用的酶制劑需要合適的反應條件才能達到最佳酶活，然而通常情況下這種最佳反應條件很難達到[1]。因此尋找能夠適應特殊環境條件的酶制劑是關鍵。放線菌是一類能夠產生多種生物活性物質的微生物資源，如酶、抗生素、氨基酸、維生素、有機酸、生物堿等均由其產生。

植物根際是指生物和物理特性受到植物根系影響的緊密環繞根部的區域。在植物根際區域內生長的微生物稱為根際微生物。據報道，根際區域微生物要比非根際區域微生物多19～32倍，根際放線菌產生抗菌物質和其他生理活性物質的比例也顯著高于根際周圍土壤來源的放線菌[2]。因此，植物根際微生物是一類值得深入研究與開發的微生物資源，從根際微生物的代謝產物中尋找各種生物活性物質是改善工業生產條件的又一重要途徑。

西北民族大學榆中校區位于甘肅省中部、省會蘭州東郊的榆中縣，榆中縣地處103°49′15″～104°34′40″E，35°34′20″～36°26′30″N。榆中縣內地層發育不全，缺失整個古生界和中生界的三疊系。縣境內的侵入巖為前古生代和早古生代晚期的酸性巖漿，其地質構造極其復雜。目前，還沒有針對我國西北民族大學榆中校區草本科植物根際放線菌資源的相關研究報道，本文采用了稀有放線菌資源選擇性分離方法，對采自西北民族大學榆中校區不同海拔梯度、不同植被類型的不同草本科植物根系土壤放線菌進行分離，并對所得菌株做了部分生理活性測定，對功能酶產生菌做了篩選。

1 材料與方法

1.1 土樣來源及處理

2016年7月下旬從西北民族大學榆中校區以及周邊選取8個不同植被類型、不同海拔梯度(海拔1 800～2 500 m)的樣區，采集到8份具有代表性的植物的根際土(0～20 cm)，各約100 g，分裝于自封袋中，貼上標簽后帶回榆中校區實驗室保存，以供分離放線菌之用。土樣概況及草本科植物的概況見表1。

表1 土樣的類型和采集地概況

1.2 菌種分離

1.2.1 分離培養基

菌種分離采用甘油精氨酸瓊脂分離培養基，其中含精氨酸2 g，NaCl 50 g，甘油12.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.000 1 g，CuSO4·5H2O 0.000 1 g，K2HPO41 g，ZnSO4·7H2O 0.000 1 g，蒸餾水 1 L，瓊脂20 g。調節pH值至8.0以上，121 ℃滅菌30 min。

在分離培養基中加入抑制劑可以有效抑制細菌和真菌的生長，抑菌劑配方：放線菌酮40 μg·mL-1,重鉻酸鉀75 μg·mL-1,青霉素2 μg·mL-1。

1.2.2 分離方法

取3 g土樣樣品，在120 ℃干熱條件下處理，1 h后用27 mL 6%酵母提取物溶液和270 μL 5% SDS溶液的混合液作為土樣提取液。采用稀釋涂布平板法進行分離，計數、純化、保藏用常規方法。

1.3 代謝產物測定

1.3.1 MR實驗

采用的培養基含蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO45 g，蒸餾水1 L，調整pH值至7.2,121 ℃滅菌20 min。甲基紅試劑由甲基紅0.1 g,95%乙醇300 mL,蒸餾水200 mL混合而成。將實驗菌接培養基中，2個重復，置22 ℃培養箱2～6 d，在培養液中加入一滴甲基紅試劑，陽性反應表現為紅色(pH 值4.4)，陰性則為黃色(pH值6.0)。

1.3.2 硫化氫的產生

采用柴斯納培養基，含蛋白胨10 g，檸檬酸鐵0.5 g，蒸餾水1 L，pH值7.2,121 ℃滅菌20 min。將實驗菌種接種于柴斯納培養基上培養，觀察2周后，產生的黑色素即為硫化氫。

1.4 功能酶產生菌的篩選

1.4.1 色氨酸酶

培養基為1%胰胨水溶液，調pH值至7.2～7.6，分裝1/4～1/3試管，于115 ℃滅菌30 min。所用試劑為對二甲基氨基苯甲醛8 g, 95%乙醇760 mL,濃HCl 160 mL。

挑取實驗菌接種于液體培養基中，每次2個重復，置22 ℃培養4、7 d，沿管壁緩緩加入3～5 mm高的試劑于培養液表面，陽性表現為液層界面為紅色，若此時顏色不明顯，可在培養液中加入4～5滴乙醚，輕輕搖動，使乙醚充分分散于液體中，靜置片刻后繼續添加試劑。

1.4.2 過氧化氫酶

挑取實驗菌株于干凈的玻片上，滴加3～4滴3%～10%過氧化氫溶液，觀察結果。陽性表現為0.5 min內產生大量氣泡，反之為陰性。

1.4.3 脲酶

采用培養基含蛋白胨1 g，NaCl 5 g，KH2PO42 g，酚紅0.012 g，葡萄糖1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH值 6.8～6.9(微黃)，于121 ℃滅菌20 min。待培養基冷卻至55 ℃時加入無菌尿素，使尿素終濃度為2%。將實驗菌株接種于培養基中，22 ℃培養4 d，觀察培養基的顏色。

1.4.4 脂酶

采用培養基含蛋白胨1 g，NaCl 5 g，CaCl2·7H2O 0.1 g，瓊脂9 g，蒸餾水1 L，pH值7.4，121 ℃滅菌20 min。待基礎培養基冷卻至40～50 ℃時，分別加入吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80三種無菌吐溫至終濃度為1%，倒平板。劃線接種實驗菌于平板，培養1～2周，每天觀察。陽性表現為生長的周圍有模糊暈圈，否則為陰性。

1.4.5 蛋白酶

采用培養基含蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，明膠200 g，蒸餾水1 L，pH值7.4，于121 ℃滅菌20 min。將實驗菌接種于明膠培養基表面，22 ℃培養一周，觀察其液化程度。

1.4.6 淀粉酶

采用淀粉水解培養基，含可溶性淀粉10 g，K2HPO40.3 g，MgCO21 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 值7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。碘液由碘片1 g,碘化鉀2 g,蒸餾水300 mL制備而成。采用點接法接種實驗菌于淀粉培養基，培養2周，待菌生長良好時，在菌落周圍滴加碘液，觀察是否有透明圈形成。

1.4.7 纖維素酶

采用纖維素水解培養基，含MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，KNO31 g，蒸餾水1 L，pH值 7.2，121 ℃滅菌30 min。將濾紙條一端接種于液體培養基中，滅菌后將實驗菌接種在液面以上的濾紙條上，一個月后觀察濾紙條是否被分解。

2 結果與分析

2.1 代謝產物

表2表明，有2株菌QL04和QL08產H2S，18株放線菌在糖代謝過程中均無有機酸產生。

2.2 功能酶產生菌

繼續對這18株形態各異的放線菌做功能酶菌株篩選，檢測結果如表3所示，發現18株放線菌中有9株放線菌產淀粉酶，16株產蛋白酶，16株產脲酶，18株產過氧化氫酶，12株產聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯酶，14株產聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯酶，7株產聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯酶，1株產色氨酸酶，3株產纖維素酶。

表2 代謝產物測定結果

注：+，陽性;-，陰性。同表3。

表3 功能酶產生菌篩選結果

3 討論

放線菌豐富的次級代謝產物作為工業、農業、食品、醫藥等行業的重要資源之一，一直備受國內外學者的關注。隨著放線菌菌種分離、純化、培養、鑒定等技術的發展，定會挖掘出更多的放線菌新種屬，發現更多的結構新穎、用途廣泛的次級代謝產物。隨著各項分析技術的逐漸進步，微生物與植物之間相關的各類信號分子及其功能的挖掘已經

成為目前研究的熱點[3]。在根際這個特殊的生態系統中,根際微生物可以通過根際產生生長素、赤霉素或激動素類物質影響植物生長。以往有關根際微生物-植物間互作的研究多集中在細菌和真菌，本文選取了西北民族大學榆中校區8種草本科植物根際土作為放線菌的分離源，放線菌與草本科植物間的互作[4]可能會對放線菌的生理產生一定的影響，有待今后做進一步深入的研究。

[1] 司美茹,薛泉宏,來航線.放線菌分離培養基篩選及雜菌抑制方法研究[J].微生物學通報,2004,31(2):61-65.

[2] 袁麗杰，章廣玲，張玉琴，等. 草本科植物根際放線菌的種群多樣性及生物活性初步研究[J].中國抗生素雜志，2009,34(8):463-466.

[3] 沈仁芳,孫波,施衛明,等. 地上-地下生物協同調控與養分高效利用[J].中國科學院院刊,2017,32(6):566-574.

[4] 陳伊,李舟,魏玉珍,等.根際放線菌I06203431產生的核苷類抗生素3431的研究[J].生物學雜志，2009，26(4)：17-20.