三種檢測技術對肺結核輔助診斷價值的研究

史祥 尹洪云 沙巍 肖和平

結核分枝桿菌培養陽性是診斷結核病的金標準，但羅氏培養法需1～2個月得出結果，快速培養法平均需要18 d，因此，臨床亟需能夠盡快得出診斷結果的方法。筆者回顧分析2014年11月至2015年10月在上海市肺科醫院住院的980例患者的臨床資料，評價采用外周血結核感染T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)、痰液結核分枝桿菌實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(simultaneous amplification and testing，SAT)，以及血清結核抗體(TB-Ab)檢測對結核病的臨床診斷價值。

對象和方法

1.對象：選取上海市肺科醫院2014年11月至2015年10月期間確診為肺結核的住院患者作為肺結核組，共689例，平均年齡(41.77±18.60)歲；其中，痰涂片結核分枝桿菌陽性者179例，陰性者510例；任何標本(痰液、胸腔積液、穿刺液、活檢標本、氣管鏡沖洗液等)涂片和(或)培養結核分枝桿菌陽性者310例，陰性者379例；初治肺結核596例，并發肺外結核者278例。選取同時期上海市肺科醫院住院的肺部非結核性疾病患者作為非肺結核組，共291例，平均年齡(53.69±16.91)歲，包括肺部惡性腫瘤68例，普通細菌性肺炎135例，支氣管擴張伴感染32例，肺真菌病11例，其他呼吸系統疾病45例(包括間質性肺病、結節病等)。腫瘤患者均經病理學、細胞學證實，其他疾病根據患者臨床癥狀體征、常規化驗檢查、影像學檢查表現及臨床治療療效等證實。兩組均已剔除細菌學培養證實為非結核分枝桿菌感染的患者；所有患者均無人類免疫缺陷病毒(HIV)感染或免疫抑制劑藥物治療史，無妊娠期婦女。

2.肺結核診斷標準：結核病的診斷參照文獻[1]。胸部CT掃描顯示的征象支持肺結核，痰涂片抗酸桿菌(acid-fast bacilli，AFB)陽性，抗結核藥物治療有效。胸部CT掃描顯示的征象支持肺結核，痰涂片AFB陰性，但具備以下其一者：痰液以外任何標本涂片或培養AFB陽性、痰液培養AFB陽性、診斷性抗結核藥物治療2個月后行胸部CT掃描復查證實有效。

3.全血T-SPOT.TB檢測：采用上海復星長征科學有限公司生產的試劑盒。使用肝素鋰抗凝真空采血管抽取患者靜脈血5 ml，18～25 ℃儲存，4 h內送檢。外周血單個核細胞的計數采用顯微鏡下人工計數法。根據抗原A(早期分泌靶抗原6)和抗原B(培養濾液蛋白10)測試孔的反應判斷結果：(1)陰性對照孔斑點數為0～5個，測試孔斑點數-陰性對照孔斑點數≥6，判斷為陽性；(2)陰性對照孔斑點數≥6，抗原A或抗原B斑點數≥2倍無反應性對照孔斑點數，判斷為陽性。

4.SAT檢測：采用上海仁度生物科技有限公司生產的SAT-TB檢測試劑盒，根據說明書進行操作。將預處理的標本按1∶100的比例用TB稀釋液(采用焦碳酸二乙酯處理過的無菌水配制的10 mmol/L檸檬酸鈉)進行稀釋，放入超聲波清洗器中進行超聲處理15 min，超聲功率為300 W。超聲處理結束后，取出2 μl處理物加入30 μl擴增檢測液(含40 mmol/L的Tris-HCL緩沖液，pH=8.1)中，開啟恒溫熒光檢測儀器(上海精宏實驗設備有限公司)，按儀器操作手冊設定反應程序，熒光素通道設定為6-羧基熒光素(FAM)42 ℃ 1 min，40個循環；熒光信號收集每分鐘進行1次，共檢測40次。反應結束后置于恒溫混勻儀(上海精宏實驗設備有限公司)中42 ℃保溫5 min，同時將SAT酶液(含M-MLV逆轉錄酶和T7 RNA轉錄酶各2000 U)也預熱到42 ℃加入反應管，快速轉至恒溫熒光檢測儀上進行檢測。

5.TB-Ab檢測：采用上海奧普生物醫藥公司的結核分枝桿菌抗體膠體金法診斷試劑盒，應用斑點免疫金滲濾法。

6.統計學分析：應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。以肺結核臨床診斷為金標準，分別評價T-SPOT.TB、SAT及TB-Ab檢測單獨及聯合檢測對肺結核診斷效能。各項指標計算方法：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。同時，繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評價各方法單獨及聯合檢測對肺結核診斷效能，計算曲線下面積(AUC)。

結 果

1.痰液SAT檢測結果：共有524例患者行痰液SAT檢測，其中肺結核組437例，非肺結核組87例。以臨床診斷為金標準，SAT檢測的敏感度為30.43%(133/437)，特異度為100.00%(87/87)，陽性預測值為100.00%(133/133)，陰性預測值為77.75%(304/391)。

2.外周血T-SPOT.TB檢測結果：共有936例患者行T-SPOT.TB檢測，其中肺結核組654例，非肺結核組282例。以臨床診斷為金標準，T-SPOT.TB檢測敏感度為90.67%(593/654)，特異度為68.09%(192/282)，陽性預測值為86.82%(593/683)，陰性預測值為75.89%(192/253)。

3.血清TB-Ab檢測結果：966例患者行血清TB-Ab檢測，其中肺結核組678例，非肺結核組288例。以臨床診斷為金標準，TB-Ab檢測敏感度為43.95%(298/678)，特異度為78.82%(227/288)，陽性預測值為83.01%(298/359)，陰性預測值為37.40%(227/607)。

4.聯合檢測的診斷價值：以肺結核臨床診斷為金標準，評價各方法聯合檢測的診斷效能，任一種檢測方法結果陽性則診斷為肺結核，聯合檢測結果均為陰性時，判斷為陰性。3種方法聯合檢測的敏感度為93.14%(285/306)，特異度為53.41%(47/88)；TB-Ab和SAT聯合檢測的敏感度為55.48%(238/429)，特異度為87.64%(78/89)；T-SPOT.TB和TB-Ab聯合檢測的敏感度為92.83%(440/474)，特異度為52.11%(148/284)； T-SPOT.TB和SAT聯合檢測的敏感度為88.89%(264/297)，特異度為61.80%(55/89)，見表1。654例肺結核患者痰涂片抗酸桿菌檢測陽性197例，敏感度為30.12%(197/654)；所有非肺結核患者痰涂片抗酸桿菌檢測均為陰性。繪制ROC曲線評價外周血T-SPOT.TB、痰液SAT、血清TB-Ab檢測診斷肺結核的價值，各檢測方法測得的曲線下面積(AUC)分別為：0.798、0.652、0.614。T-SPOT.TB+SAT+TB-Ab、T-SPOT.TB+SAT、T-SPOT.TB+TB-Ab、SAT+TB-Ab檢測的AUC分別為：0.865、0.826、0.843、0.732。

討 論

早診斷和早治療對于結核病防治至關重要，與傳統的培養法相比，SAT法檢測各類臨床標本中的結核分枝桿菌具有快速和敏感度高的優勢[2-5]。van der Vliet等[6]在1994年通過體外擴增16S rRNA進行分枝桿菌活性檢測和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。試驗證實RNA分子半衰期短，是結核分枝桿菌活菌的標志，可直接檢測細菌活性，突出了活菌檢測的價值和臨床意義[2-3]，并且自然條件下RNA易降解，標本不易被污染。痰液SAT檢測技術是針對結核分枝桿菌特有的16S RNA或DNA進行擴增，特異度高，不易出現假陽性。van der Vliet等[6]報道，患者體內的結核分枝桿菌菌株可能為沒有代謝活性的死菌，SAT法可用于鑒定痰液中結核分枝桿菌是否為活菌，幫助觀察療效。倪麗麗等[7]提出，SAT法擴增過程敏感度較高，當標本中結核分枝桿菌活力較差或存在擴增抑制因子，或者核酸抽提效率不高時可能出現假陰性，應在SAT-TB法檢測體系中加入質控擴增體系，以更加有效地判斷SAT-TB法陰性檢測結果。當標本中菌量較少或細菌活力較差而導致其在培養基中無法生長時，因活菌中16S RNA拷貝數較DNA的拷貝數高，使得SAT-TB檢測敏感度較以DNA為檢測靶標的核酸擴增PCR熒光體外檢測法的敏感度更高。本次研究結果顯示，以肺結核臨床診斷作為金標準，SAT-TB法的敏感度為30.43%，特異度為100.00%，陽性預測值為100.00%，陰性預測值為77.75%，單獨用于診斷肺結核時，具有一定的參考價值(AUC=0.652)。本次研究結果中，SAT-TB檢測敏感度低于羅賢等[8](59%)和Cui等[9](67.6%)研究結果，可能與患者選擇、送檢痰液標本質量與存放送檢條件限制等有關。

表1 3種檢測技術不同聯合檢測方式對肺結核的診斷效能

注聯合檢測時任一種方法檢測結果陽性則判斷為陽性，聯合檢測結果均為陰性時判斷為陰性

T-SPOT.TB可檢測外周血中結核分枝桿菌特異性釋放γ干擾素的T細胞，與卡介苗無交叉免疫反應，但無法區分活動性結核病還是潛伏感染[10]。本研究結果顯示，以肺結核臨床診斷為金標準，T-SPOT.TB檢測敏感度最高(90.67%)，但特異度(68.09%)較SAT(100.00%)低，陽性預測值為86.82%，陰性預測值為75.89%；與潘麗萍等[11]的研究結果相近，略高于Metcalfe等[12]的Meta分析結果，即T-SPOT.TB在中低收入國家診斷肺結核的綜合敏感度為83%(95%CI：63%～94%)，綜合特異度為61%(95%CI：40%～79%)。ROC曲線分析顯示T-SPOT.TB檢測輔助診斷肺結核價值較高(AUC=0.798)。潘麗萍等[11]也提出，相對于老年肺結核患者，T-SPOT.TB對中青年肺結核患者有較好的輔助診斷價值。在其他研究中，Ferguson等[13]、Escalante等[14]、萬榮等[15]等提出，T-SPOT.TB在做血液透析患者、風濕性疾病患者，以及老年患者中篩查近期結核感染的敏感度、特異度、診斷符合率也都高于TB-Ab檢測結果。

血清TB-Ab檢測是目前臨床開展最早、應用最廣泛的快速檢測方法。以肺結核臨床診斷為金標準，血清TB-Ab檢測敏感度較低(43.95%)，特異度為78.82%，與SAT檢測及T-SPOT.TB檢測比較，其敏感度和特異度均不高。

筆者進一步分析了SAT、T-SPOT.TB、TB-Ab等檢測方法不同組合方式聯合檢測結核病的診斷價值。結果顯示，敏感度及特異度均有不同程度提高，3種方法聯合檢測時診斷價值最高(AUC=0.865)，T-SPOT.TB聯合TB-Ab檢測的診斷價值次之(AUC=0.843)。

[1] 中華醫學會結核病學分會. 肺結核診斷和治療指南. 中華結核和呼吸雜志, 2001, 24(2): 70-74.

[2] Greco S, Girardi E, Navarra A, et al. Current evidence on diagnostic accuracy of commercially based nucleic acid amplification test for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Thorax, 2006, 61(9): 783-790.

[3] Sandin RL. Polymerase chain reaction and other amplification techniques in mycobacteriology. Clin Lab Med, 1996, 16(3): 617-639.

[4] Guerra RL, Baker JF, Alborz R, et al. Specimen dilution improves sensitivity of the amplifiedMycobacteriumtuberculosisdirect test for smear microscopy-positive respiratory specimens. J Clin Microbiol, 2008, 46(1): 314-316.

[5] Guerra RL, Hooper NM, Baker JF, et al. Use of the amplifiedMycobacteriumtuberculosisdirect test in a public health laboratory: test performance and impact on clinical care. Chest, 2007, 132(3): 946-951.

[6] van der Vliet GM, Schepers P, Schukkink RA, et al. Assessment of mycobacterial viability by RNA amplification. Antimicrob Angents Chemother, 1994, 38(9): 1959-1965.

[7] 倪麗麗, 羅柳林, 景玲杰, 等. 恒溫擴增實時熒光檢測技術在肺結核診斷中的臨床價值. 中華檢驗醫學雜志, 2012, 35(8): 702-705.

[8] 羅賢, 張臘紅, 洪理泉, 等. 恒溫擴增實時熒光檢測技術在肺結核患者診斷中的應用. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2015, 29(2): 183-185.

[9] Cui Z, Wang Y, Fang L, et al. Novel real-time simultaneous amplification and testing method to accurately and rapidly detectMycobacteriumtuberculosiscomplex. J Clin Microbiol, 2012, 50(3): 646-650.

[10] 石瑞如, 張國龍. 抗原誘發的γ-干擾素測定. 中國防癆雜志, 2006, 28(5): 317-320.

[11] 潘麗萍, 賈紅彥, 劉菲, 等. γ-干擾素釋放試驗對不同年齡組疑似肺結核的輔助診斷價值. 中華結核和呼吸雜志, 2015, 38(12): 892-896.

[12] Metcalfe JZ, Everett CK, Steingart KR, et al. Interferon-γ release assays for active pulmonary tuberculosis diagnosis in adults in low- and middle-income countries: systematic review and meta-analysis. J Infect Dis, 2011, 204 Suppl 4: S1120-S1129.

[13] Ferguson TW，Tangri N，Macdonald K，et al. The diagnostic accuracy of tests for latent tuberculosis infection in hemodialysis patients：a systematic review and meta-analysis. Transplantation, 2015, 99(5): 1084-1091.

[14] Escalante P, Kooda KJ, Khan R, et al. Diagnosis of latent tuberculosis infection with T-SPOT(?).TB in a predominantly immigrant population with rheumatologic disorders. Lung, 2015, 193(1): 3-11.

[15] 萬榮, 李明武, 賴明紅, 等. 結核感染T 細胞斑點試驗在老年肺結核中的診斷價值. 中國防癆雜志, 2015, 37(4): 348-352.