小鼠心臟縫隙連接蛋白節律性表達與生物鐘系統相關性

柴瑩，周影，陳曉敏，童茂清

（寧波市第一醫院，浙江 寧波 315010，1.中西醫結合科；2.分子醫學實驗室；3.心內科）

心律失常是心血管系統常見病、多發病，心肌細胞的異常興奮（如離子通道功能異常等）和細胞間傳導異常（如縫隙連接蛋白異常等）是心律失常發生的主要原因。鑒于心律失常發病的顯著節律性，大量研究探索了生物鐘與心律失常的可能聯系。YAMASHITA等[1]的研究顯示，幾種心臟鉀離子通道基因的表達有顯著的節律性。本課題組前期研究提示，視上核可能通過自主神經系統調節著心臟離子通道的節律性表達[2]。然而，心臟縫隙連接蛋白基因的表達是否同樣具有節律性，及其與生物鐘系統的相關性尚未見報道。為此，本研究觀察在小鼠心臟中縫隙連接蛋白基因的表達情況，以及生物鐘系統對縫隙連接蛋白基因的調節作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6周齡C57BL/6小鼠[購自南京大學模式動物研究所，生產許可證號為SCXK（蘇）2010-0001]和Clock mutant小鼠（購自美國杰克遜實驗室）各40只被單獨飼養在12 h光照/12 h黑暗環境下2周（8：00開燈，20：00關燈），可自由進食飲水。本研究通過寧波大學醫學院實驗動物福利委員會批準。1.2 RNA回收及實時熒光定量PCR 在苯巴比妥鈉麻醉下，每6 h處死10只小鼠，快速回收心房、心室組織，保存于RNA保存液中（RNAlater，美國賽默飛世爾公司）。采用RNeasy1 Fibrous Tissue Mini kit（德國Qiagen公司）回收總RNA，反轉錄之前檢測RNA的濃度和純度，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，以GAPDH作為內參，在StepOne-PlusTM（美國ABI公司）上檢測各基因mRNA水平。反應條件為：94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。實驗中使用的PCR引物見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 統計學處理方法 各基因的mRNA水平的24 h變化節律用least-squares cosine-curve fitting法分析。以下參數被用于分析晝夜節律的特點：①節律的顯著性；②周期性變化數值的算術平均值；③振幅和時相。各參數用 ±s表示，2組參數的比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Clock變異小鼠的生物鐘系統失去正常功能在野生型小鼠的心房和心室中，生物鐘基因Per2

和鐘控基因Dbp的mRNA水平顯示出顯著的晝夜節律性；在Clock變異小鼠中，兩基因表達均失去節律性，且各基因表達的均值和振幅均顯著低于野生型小鼠，表明該小鼠體內的生物鐘系統失去正常功能。見圖1。

2.2 小鼠心臟中縫隙連接蛋白基因的表達呈顯著晝夜節律性 在野生型小鼠的心臟中，兩種縫隙連接蛋白基因Cx40和Cx43的mRNA水平具有顯著的晝夜節律性：在心房中，兩基因的表達峰值均出現在光照階段，而在心室中，僅Cx43的表達峰值出現在光照階段（見圖2）。在Clock變異小鼠中，心臟內的兩種縫隙連接蛋白基因表達的節律性依然存在，但其節律的時相性發生顯著變化：在心房中，Cx40和

圖1 生物鐘基因在心房（A）和心室（B）中的表達情況（n=10）

圖2 縫隙連接蛋白基因在心房（A）和心室（B）中的表達情況（n=10）

Cx43的表達時相顯著后移；而在心室中，兩基因的表達時相顯著前移。Clock變異小鼠心室中兩基因表達的均值較野生型小鼠顯著增加，而兩基因表達的振幅及在心房內表達的均值差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2-3。

表2 各基因在野生型及Clock變異小鼠心房中的表達節律相關參數比較（n=10， ±s）

表3 各基因在野生型及Clock變異小鼠心室中的表達節律相關參數比較（n=10， ±s）

3 討論

心律失常的發生與異常心肌細胞電活動及（或）細胞間電傳導異常相關，這涉及一系列的心臟離子通道和縫隙連接蛋白基因。在過去40多年里，大量證據提示了縫隙連接和縫隙連接蛋白對正常心臟功能的重要性[3-4]?？p隙連接蛋白是構成縫隙連接的基本單位，現在已知的縫隙連接蛋白有20多種，其中有4種在心臟中表達，包括Cx40、Cx43、Cx45和Cx30.2[5]。在心血管疾病中，其分布異?；虮磉_下調，從而導致心律失?；|的產生。例如慢性壓力超負荷/左室收縮功能不全大鼠模型中，心肌細胞Cx43陽性縫隙連接的減少和（或）分布異常與房顫的高發密切相關[6]，心肌細胞縫隙連接重塑也與高甘油三酯血癥大鼠增加的室顫發生率相關[7]

心律失常的發病有顯著的晝夜節律性，研究表明這與離子通道基因表達及功能的節律性、心臟生理功能對自主神經系統的反應有關[8]。哺乳動物的生物鐘中樞位于下丘腦的視上核，此外在包括心臟的幾乎所有的外周臟器中均存在外周生物鐘系統。視上核通過自主神經/神經體液途徑發出的信號驅動并同步化各種行為和生理過程的節律。當視上核被破壞后，這種節律性被打亂并引起一系列的下游效應[9]。

本研究利用Clock變異小鼠觀察了Cx40和Cx43基因在心臟中的表達節律，Per2和Dbp基因被用作正常生物鐘系統功能的標志，結果顯示在野生型小鼠中，Cx40和Cx43的表達呈顯著節律性，而在Clock變異小鼠中，這種節律性雖然保持，但其時相發生顯著變化，這意味著在正常的生物鐘功能缺失的情況下，縫隙連接蛋白基因的表達與外界環境失去同步性。

許多心血管參數如血壓、心率等均表現出明顯晝夜變化，這一現象之前主要被歸因于外界環境刺激的晝夜變化。隨著對生物鐘系統研究的不斷深入，生物鐘在心血管系統中的作用日益受到重視。生物鐘可能給心臟提供了一種手段，使得心血管系統可以“預測”外界環境的變化，從而可以提前做好準備并做出最適當的反應，而生物鐘系統功能的異?？赡軙p害這一機制進而導致心血管疾病的發生[10-11]。HAVAKUK等[12]的研究發現，夜班輪班工人的心血管疾病發病率高于白班輪班工人，提示反復變化的作息時間可能導致生物鐘系統功能受損，進而導致心血管疾病的發生。反之，心血管疾病也可能導致其本身的外周生物鐘系統的異常，進而加重原有疾病。YOUNG等[13]報道，在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型中，心臟的生物鐘系統功能受損。本研究顯示在機體生物鐘系統喪失正常功能時，Cx40和Cx43基因表達節律紊亂，這可能導致心臟電生理功能無法與機體的需求同步。

本研究結果提示了生物鐘系統可能參與了縫隙連接蛋白基因的節律性表達，而生物鐘功能異常會引起這一節律的紊亂，在未來研究中深入觀察在各種心血管疾病患者及動物模型中生物鐘與縫隙連接蛋白基因的相關性將有可能進一步闡明這一調節的分子機制，并有可能發現新的心律失常的治療靶點，而對每個患者個體生物節律的評估則有可能為疾病的個體化治療提供更多依據。