DRD4基因多態(tài)性對(duì)注意缺陷多動(dòng)障礙兒童靜息態(tài)腦功能磁共振的影響

錢(qián)安丹，王美豪，王欣，劉會(huì)茹，李建策，楊闖

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015；2.鹽城市第一人民醫(yī)院 放射科，江蘇鹽城 224000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 精神病與精神衛(wèi)生科，浙江 溫州 325015）

注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD），又稱為多動(dòng)癥，是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的精神和行為問(wèn)題之一。目前認(rèn)為是一種多基因遺傳的疾病，與多巴胺傳遞系統(tǒng)的異常相關(guān)。多巴胺傳遞系統(tǒng)中研究的熱點(diǎn)基因多態(tài)性位點(diǎn)是多巴胺D4受體（dopamine D4 receptor，DRD4）基因第3號(hào)外顯子48 bp的重復(fù)次數(shù)。許多學(xué)者通過(guò)影像遺傳學(xué)方法研究DRD4基因多態(tài)性對(duì)腦功能產(chǎn)生的影響[1-3]。局部一致性（regional homogeneity，ReHo）和基于種子點(diǎn)的功能連接分析方法可分別衡量靜息狀態(tài)下局部腦區(qū)的功能[4]和特定腦區(qū)的功能聯(lián)系[5]。目前尚缺乏DRD4基因多態(tài)性對(duì)ADHD兒童靜息態(tài)功能磁共振（functional magnetic resonance imaging，fMRI）的成像分析，基于前人的研究結(jié)果，可推測(cè)DRD4不同基因型在靜息態(tài)fMRI成像中也將顯示出局部腦區(qū)和功能連接的差異。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 2012年9月至2014年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院精神病與精神衛(wèi)生科門(mén)診就診的ADHD兒童56例，年齡7～15歲，均為漢族。入選標(biāo)準(zhǔn)：未經(jīng)過(guò)臨床ADHD藥物治療，由2位以上臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的精神科醫(yī)師根據(jù)《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版（DSM-IV）診斷標(biāo)準(zhǔn)確診ADHD。排除標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)學(xué)齡兒童情感障礙和精神分裂癥問(wèn)卷（K-SADS-PL）終生版排除品行障礙、對(duì)立違抗性障礙等其他精神病伴發(fā)疾病；②服用過(guò)哌酸甲酯等中樞神經(jīng)興奮劑類藥物，有藥物濫用史；③曾發(fā)生伴有意識(shí)喪失的頭部損傷，有神經(jīng)系統(tǒng)疾病史及其他重大軀體疾病史；④中國(guó)修訂版韋氏智力量表篩查智商小于75。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有患兒均由其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 基因型測(cè)定：采集靜脈血樣5 mL，采用基因組DNA試劑盒提取基因組DNA。用primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物：5’-GCGACTACGTGGTCTAC TCG-3’，下游引物：5’-AGGACCCTCATGGCCTTG-3’。PCR所用試劑：KAPA2G Fast Multiplex Mix。通過(guò)PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)打印出的彩色測(cè)序圖譜，讀取基因型。所有受檢者均按DRD4第3外顯子48 bp數(shù)目可變重復(fù)串聯(lián)序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多態(tài)性進(jìn)行基因分型。

1.2.2 數(shù)據(jù)采集：MRI掃描在美國(guó)GE 3Tesla MR儀上進(jìn)行，使用標(biāo)準(zhǔn)8通道頭線圈。掃描全程，受檢者被要求配合塞海綿耳塞以減少掃描機(jī)器噪聲，海綿墊固定頭部以減少頭部運(yùn)動(dòng)。受檢者被要求放松，保持不動(dòng)，閉上眼睛，保持清醒，盡量避免思維活動(dòng)。先掃描大腦的結(jié)構(gòu)相，以排除腦結(jié)構(gòu)性病變。靜息態(tài)功能圖像依賴的血氧水平波動(dòng)（blood oxygen level dependency，BOLD）信號(hào)采用平面回波成像序列采集（TR=2 000 ms，TE=30 ms，翻轉(zhuǎn)角90°，F(xiàn)OV=192 mm×192 mm，矩陣=64×64，層數(shù)31層，層厚為4 mm，層間隔0.2 mm，體積數(shù)240）。掃描全程由監(jiān)護(hù)者陪同，保證兒童安全。

1.2.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理：數(shù)據(jù)預(yù)處理均采用北京師范大學(xué)團(tuán)隊(duì)基于Matlab7.12.0（R2011a）平臺(tái)開(kāi)發(fā)的DPARSF軟件批量處理。首先，去除掃描開(kāi)始后前10個(gè)時(shí)間點(diǎn)圖像，對(duì)余下的230個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)繼續(xù)以下處理：①時(shí)間層校正。②頭動(dòng)校正：使用3個(gè)平移參數(shù)和3個(gè)旋轉(zhuǎn)參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，剔除了7個(gè)頭動(dòng)平移大于3.0 mm或旋轉(zhuǎn)移動(dòng)大于3.0°的數(shù)據(jù)，剩余49個(gè)患者納入統(tǒng)計(jì)分析。③空間標(biāo)準(zhǔn)化：將蒙特利爾神經(jīng)病學(xué)研究所（Montreal Neurological Institute，MNI）標(biāo)準(zhǔn)三維腦模板疊加至所有受檢者的腦圖像上以消除每個(gè)受檢者腦空間結(jié)構(gòu)上的差異，重采樣體素大小為3 mm×3 mm×3 mm。

1.2.4 局部一致性分析：在數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)束后，繼續(xù)在DPARSF軟件上進(jìn)行以下步驟： ①去線性漂移：降低由于MRI設(shè)備發(fā)熱以及因受檢者的適應(yīng)存在線性趨勢(shì)所造成的影響。 ②低頻濾波：選擇0.01～0.08 Hz的頻率范圍。③計(jì)算全腦每個(gè)體素與其相鄰數(shù)個(gè)體素間在時(shí)間序列上的相似性，Cluster Size設(shè)為27 voxles，體素大小為3 mm×3 mm×3 mm，得到該體素的肯德?tīng)柡椭C系數(shù)（Kendall’scoefficient concordance，KCC）。以每一個(gè)體素的KCC值除以全腦全部體素KCC的均值，獲得標(biāo)準(zhǔn)化的全腦ReHo圖。④空間平滑，使用全寬半高為4 mm×4 mm×4 mm的高斯函數(shù)進(jìn)行空間平滑。

1.2.5 功能連接分析：功能連接分析是在預(yù)處理結(jié)束后，繼續(xù)在DPARSF軟件上進(jìn)行以下步驟：①空間平滑。②去線性漂移。③低頻濾波。④去除協(xié)變量，去除6個(gè)在校正中獲得的頭動(dòng)參數(shù)、全腦信號(hào)、白質(zhì)以及腦脊液信號(hào)。⑤定義ROI采用種子相關(guān)分析方法，選取的ROI是從ReHo的變化得出的腦激活圖中。研究指出角回間接參與認(rèn)知及注意力的調(diào)控，并與ADHD的發(fā)病關(guān)系密切，因此選取左側(cè)角回為感興趣區(qū)。⑥計(jì)算ROI的平均時(shí)間序列，并將該平均時(shí)間序列與全腦其余體素的時(shí)間序列作Pearson相關(guān)分析，以其相關(guān)系數(shù)值作為功能連接的強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 將DRD4 4R/4R基因型的ADHD患兒與DRD4 2R基因型的ADHD患兒的ReHo圖及功能連接圖導(dǎo)入Matlab 7.12.0（R2011a）平臺(tái)的靜息態(tài)磁共振數(shù)據(jù)分析工具包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行2組之間的比較，多重比較校正采用Alphasim算法，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。得到cluster size＞486 mm3認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果在Slice Viewer中顯示，并記錄這些差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的ReHo值（用“t”表示，t值越大，則相鄰體素間的相似程度越高）和相關(guān)強(qiáng)度（用“t”表示，t值越大，則腦區(qū)間連接的相關(guān)性越強(qiáng)）。計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 所有納入的受檢者根據(jù)DRD4重復(fù)等位基因的次數(shù)分為攜帶DRD4 4次重復(fù)等位（4R/4R）基因型的ADHD兒童（DRD4 4R/4R組）與攜帶DRD4 2次重復(fù)等位（2R）基因型的ADHD兒童（DRD4 2R組）。其中DRD4 4R/4R組30例；DRD4 2R組19例，其中2R/4R基因型16例，2R/2R基因型1例，2R/5R基因型1例，2R/3R基因型1例。本組患兒中DRD4 48 bp VNTR多態(tài)性以4R（占46.9%）為主，其次是2R（占20.4%）。2組患兒符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。2組患兒性別及ADHD亞型比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.024、1.097，P＞0.05），年齡和智商差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.846、0.173，P＞0.05）。臨床量表的行為評(píng)估包括Conners父母用量表、Stroop效應(yīng)色詞測(cè)試和威斯康星卡片分類測(cè)試，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 ReHo結(jié)果 DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組ADHD兒童在靜息狀態(tài)下ReHo變化的腦區(qū)（Alphasim校正，P＜0.01）。ReHo值升高的腦區(qū)主要有：兩側(cè)小腦后葉、舌回，右側(cè)枕葉、枕顳內(nèi)側(cè)回、枕顳外側(cè)回；ReHo值降低的腦區(qū)主要有：左側(cè)緣上回、角回、中央前回，見(jiàn)表2和圖1。

2.3 功能連接結(jié)果 在靜息狀態(tài)下DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組ADHD兒童以左側(cè)角回為種子點(diǎn)得到的功能連接變化的腦區(qū)，功能連接增強(qiáng)的腦區(qū)主要有：兩側(cè)小腦前葉、中腦，右側(cè)額下回、顳中回、顳上回、楔前葉；功能連接減弱的腦區(qū)主要有：兩側(cè)枕葉，左側(cè)額上回、額內(nèi)側(cè)回、直回、頂上小葉，右側(cè)楔葉，見(jiàn)表3和圖2。

表1 DRD4 4R/4R組和DRD4 2R組ADHD兒童的臨床資料比較（ ±s）

表2 DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組ADHD兒童ReHo值變化的腦區(qū)

圖1 DRD4 4R/4R組和DRD4 2R組ADHD兒童ReHo值變化的腦激活圖譜

3 討論

多巴胺系統(tǒng)的紊亂被認(rèn)為是很多精神疾病的病理機(jī)制，也是ADHD的發(fā)病機(jī)制之一。DRD4是一種DRD4基因編碼的G蛋白耦聯(lián)受體，DRD4基因的重復(fù)等位基因變異次數(shù)可從2次到11次，最常見(jiàn)的是4次、7次和2次，平均所占比例分別約為67%、12%和10%。在本研究的基因型分析中，因樣本中7R等位基因的缺失，將其分為DRD4 4R/4R等位基因組和2R等位基因組，可獨(dú)立探究2R基因型對(duì)腦功能的影響。對(duì)于DRD4在人腦中的分布仍存在爭(zhēng)議[6]。一項(xiàng)采用RTPCR技術(shù)檢測(cè)人腦組織的研究得出DRD4在額葉腦區(qū)、扣帶回以及顳葉、海馬、杏仁核、枕葉和小腦等腦區(qū)表達(dá)較高，而在黑質(zhì)、紋狀體和頂葉等腦區(qū)的表達(dá)程度則相對(duì)較低[7]，本研究也顯示DRD4高表達(dá)區(qū)在靜息狀態(tài)下有顯著的局部一致性的改變和功能連接的異常。DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組相比，ReHo值升高以右側(cè)為主，顳枕葉及小腦顯著，ReHo值降低主要集中在左側(cè)角回腦區(qū)附近；功能連接增強(qiáng)以右側(cè)額葉-小腦環(huán)路為著，降低以兩側(cè)枕葉區(qū)及左側(cè)額葉腦區(qū)顯著。

本研究中DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組相比，ReHo值升高包括右側(cè)顳枕葉、兩側(cè)舌回及兩側(cè)小腦。相關(guān)fMRI研究發(fā)現(xiàn)，在7～13歲的兒童大腦發(fā)育過(guò)程中，舌回區(qū)域的BOLD信號(hào)強(qiáng)度和范圍與這些區(qū)域的神經(jīng)元髓鞘形成密切相關(guān)[8]。此后龐高峰等[9]利用靜息態(tài)fMRI對(duì)學(xué)齡期兒童的研究顯示，隨著年齡增長(zhǎng)，舌回區(qū)域的神經(jīng)元髓鞘逐漸形成，從而引起該腦區(qū)ReHo值增高，同時(shí)與之相關(guān)的認(rèn)知功能也逐漸增強(qiáng)?？梢酝茰y(cè)DRD4 2R基因型患兒可能相對(duì)于4R/4R基因型患兒神經(jīng)元髓鞘發(fā)育延遲，與ADHD神經(jīng)發(fā)育延遲的病因假說(shuō)[10]一致。

本研究結(jié)果顯示ReHo值降低主要集中在左側(cè)角回腦區(qū)附近。已有影像學(xué)研究證實(shí)角回與ADHD關(guān)系密切[11]。有研究指出角回間接參與認(rèn)知及注意力的調(diào)控，角回作為多模式整合中心，在完成諸如閱讀、理解、空間認(rèn)知和注意力等任務(wù)時(shí)被激活[12]。角回也是額-頂葉網(wǎng)絡(luò)的一部分，負(fù)責(zé)整合內(nèi)部和外部信息以做出應(yīng)答。ADHD任務(wù)態(tài)fMRI的研究中，已發(fā)現(xiàn)涉及抑制運(yùn)動(dòng)的任務(wù)會(huì)導(dǎo)致此網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的活動(dòng)度減低[11]。本研究顯示DRD4 4R/4R基因型的左側(cè)角回ReHo較DRD4 2R基因型明顯降低，表明DRD4基因多態(tài)性可能參與調(diào)節(jié)角回的活動(dòng)。

本研究發(fā)現(xiàn)DRD4基因不僅可以調(diào)節(jié)局部的腦區(qū)活動(dòng)，同時(shí)對(duì)腦區(qū)之間的連接也有顯著的作用。DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組相比，兩側(cè)小腦的Reho值升高，與左側(cè)角回之間功能連接增強(qiáng)的腦區(qū)也包括了右側(cè)額葉-小腦環(huán)路。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為小腦參與調(diào)節(jié)軀體平衡和肌肉張力，以及協(xié)調(diào)隨意運(yùn)動(dòng)，但已有研究證實(shí)小腦與高級(jí)皮層有廣泛連接，該通路被認(rèn)為與認(rèn)知功能和執(zhí)行控制功能相關(guān)。GILSBACH等[2]也發(fā)現(xiàn)非DRD4 7R等位基因攜帶者（以4R基因型為主）在執(zhí)行控制任務(wù)中可表現(xiàn)出小腦與前扣帶回、額下回腦區(qū)間呈血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的強(qiáng)連接。有學(xué)者認(rèn)為ADHD患者伴有執(zhí)行功能缺陷[5]，且不同DRD4基因型在多動(dòng)沖動(dòng)癥狀有顯著差異[1]，但本研究中2組間執(zhí)行功能任務(wù)與多動(dòng)沖動(dòng)癥狀指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1），可能與樣本量較少有關(guān)。

表3 DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組ADHD兒童以左側(cè)角回為種子點(diǎn)得到的功能連接變化的腦區(qū)

圖2 靜息狀態(tài)下DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組 ADHD兒童以左側(cè)角回為種子點(diǎn)得到的功能連接圖譜

DRD4 4R/4R組與DRD4 2R組相比，與左側(cè)角回之間功能連接降低以兩側(cè)枕葉區(qū)及左側(cè)額葉腦區(qū)顯著。任務(wù)態(tài)fMRI研究中發(fā)現(xiàn)DRD4基因可調(diào)控平均BOLD信號(hào)的改變，在右側(cè)額下回、枕葉和小腦區(qū)域有顯著的血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[13]，與本研究結(jié)果一致。目前有效的ADHD治療藥物哌酸甲酯可改善臨床癥狀，可顯著地減少ADHD患兒視皮層區(qū)域的局部腦血流量[14-16]。視皮層區(qū)域的活動(dòng)增強(qiáng)也被認(rèn)為與ADHD患者的注意力缺失相關(guān)[14]。這些結(jié)果提示DRD4 2R組較DRD4 4R/4R組患兒的注意力缺陷癥狀可能更顯著，雖目前沒(méi)有可靠的臨床指標(biāo)支持，但可為DRD4基因?qū)DHD患兒枕葉腦區(qū)的調(diào)控作用提供影像基礎(chǔ)。

本研究中DRD4 4R/4R組的左側(cè)額上回、額內(nèi)側(cè)回、直回較DRD4 2R組的功能連接明顯下降，與DURSTON等[17]的研究結(jié)果相似。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明DRD4多態(tài)性可調(diào)控前額葉皮層同步網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)[18]，這一結(jié)果也在正常青少年fMRI研究中得到證實(shí)[2]。此外，“冷”執(zhí)行功能主要受前額葉腦區(qū)調(diào)控，與注意缺陷癥狀有關(guān)，DRD4基因可調(diào)控前額葉等控制功能腦區(qū)的多巴胺功能[13]。故有研究提出DRD4 2R基因型對(duì)執(zhí)行控制功能產(chǎn)生影響[19]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證DRD4基因多態(tài)性與左側(cè)額葉活動(dòng)的相關(guān)性，而右側(cè)額葉-小腦環(huán)路連接增強(qiáng)可能是對(duì)左側(cè)額葉腦區(qū)功能連接降低的一種補(bǔ)償。

研究發(fā)現(xiàn)ADHD患者在紋狀體區(qū)有顯著的腦功能改變，而且額葉-紋狀體通路的異常在ADHD的發(fā)病機(jī)制中有相當(dāng)重要的地位[20]，然而本研究結(jié)果卻未發(fā)現(xiàn)這種顯著差異性?？赡苁怯捎谖覀冞x取的DRD4在紋狀體區(qū)表達(dá)水平較低，但仍顯示額葉-小腦環(huán)路的異常連接，與之前的研究[5，21-23]相符。以患有ADHD的男孩與未患病的兄弟姐妹為樣本的研究提示小腦可能與ADHD的遺傳風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[24]。小腦與大腦一樣有著復(fù)雜的神經(jīng)聯(lián)系，小腦的高級(jí)認(rèn)知作用也是不可忽視的，其結(jié)構(gòu)和功能上的改變?cè)贏DHD發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

本研究聯(lián)合ReHo與功能連接兩種分析方法，從局部腦區(qū)活動(dòng)和特定腦區(qū)間連接出發(fā)，更全面地分析ADHD在DRD4基因影響下的病理生理基礎(chǔ)。研究對(duì)象基于未服用過(guò)哌酸甲酯治療的ADHD患兒，均為漢族，有利于減少混雜因素的影響[21]。由于該人群樣本的獨(dú)特性，同時(shí)研究了DRD4 2R基因型對(duì)ADHD患兒的影響。但本研究仍有一些局限性，首先，本研究中未發(fā)現(xiàn)DRD4不同基因型之間的臨床量表差異，包括執(zhí)行控制功能和多動(dòng)沖動(dòng)癥狀，仍需擴(kuò)大樣本量以尋找ADHD的臨床指標(biāo)與影像遺傳學(xué)上的關(guān)聯(lián)；其次，ADHD患兒的亞型也可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生混雜效應(yīng)[25]，這一點(diǎn)未進(jìn)行事先的分組討論，將來(lái)的研究可以著重研究不同ADHD亞型之間的fMRI區(qū)別；最后，橫斷面設(shè)計(jì)限制了研究結(jié)果的有效性，但是，可行性的研究成果為未來(lái)的縱向研究提供了研究基礎(chǔ)。

綜上所述，DRD4基因多態(tài)性對(duì)ADHD患兒的局部功能區(qū)和特定功能腦區(qū)的連接產(chǎn)生了顯著的影響，主要包括額葉-小腦環(huán)路的異常改變，涉及抑制控制及執(zhí)行控制功能的腦區(qū)，進(jìn)一步提示小腦與ADHD的相關(guān)性，為解釋ADHD患兒的神經(jīng)機(jī)制提供了影像病理基礎(chǔ)。