c-Jun氨基末端蛋白激酶在人角膜上皮細胞調控NLRP3炎癥小體激活中的作用

譚秋凡，陳淮程，朱奕睿，朱韓磊，鄭欽象，陳蔚

（1.溫州醫科大學附屬眼視光醫院 角膜病專科，浙江 溫州 325027；2.義烏市婦幼保健院 五官科，浙江 金華 322000）

最近一項Meta分析[1]顯示：有17%的國民患有干眼，其中40歲以上女性高達21.6%，顯著高于男性（占12.5%）[2]。而超過60歲的人群中有34.4%患有干眼。近年來，干眼的患病率逐年上升，并且發病趨于年輕化[3]，嚴重影響生活質量、學習工作效率。淚液高滲透性和炎癥反應被認為是干眼發病的關鍵機制之一。前期的研究證實NLRP3炎癥小體在干眼發病進程中發揮啟動炎癥的作用[4-5]，但活性氧（reactive oxygen species，ROX）如何激活NLRP3炎癥小體，如何調控NLRP3的活化及表達目前仍無定論。c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）在一系列外界刺激下，如滲透壓、熱休克、紫外線照射等會發生磷酸化反應，調節細胞增殖、再生、凋亡等過程[6]。本研究以人角膜上皮細胞（human corneal epithelial cells，HCECs）株為研究對象，通過JNK抑制劑SP600125抑制JNK的活性，進一步探討JNK在HCECs調控NLRP3炎癥小體激活中的作用，從而為干眼治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要材料 人12-SV40角膜上皮細胞株（CRL-11135，HCECs）購買于美國ATCC公司；JNK抑制劑SP600125購自美國Sigma公司；兔抗人JNK抗體、兔抗人p-JNK抗體、兔抗人NLRP3抗體、兔抗人caspase-1抗體、兔抗人IL-1β抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）購自合肥Biosharp公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；DMEM/F12培養基、0.25%含EDTA胰酶、人表皮生長因子購自美國Gibco公司；引物購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，同時加入胰島素和人表皮生長因子，使胰島素在培養基里的終濃度為5 μg/mL，人表皮生長因子的終濃度為10 ng/mL。并將其置于溫度為37 ℃、含5% CO2、濕度為90%的細胞培養箱內常規傳代培養。待細胞生長至70%～90%的融合狀態用于實驗。

1.2.2 溶液的配制：①高滲液（500 mOsm）的配制：向無血清的DMEM/F12培養基中加90 mmol/L NaCl溶液配制而成。②SP600125配置：將10 mg的SP600125干粉劑溶于1 mL的37 ℃ DMSO溶液中，配制成104 μg/mL的母液，-20 ℃冰箱保存備用；用不含血清的培養基稀釋母液，配制成終濃度為20 μmol/L的JNK抑制劑用于實驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測JNK、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β等的mRNA：取接種于12孔板的HCECs，棄舊培養基，給含500 mOsm高滲液的高滲培養基和正常等滲培養基，繼續培養4 h后，收集細胞備用。相同實驗重復3次。按RNA提取試劑盒說明書提取細胞的RNA，并根據所測濃度計算出合成cDNA模板所需的總RNA量。利用M-MLV反轉錄試劑盒合成cDNA，將反轉錄得到的cDNA -20 ℃保存，后續進行PCR的擴增。基因引物序列如下：JNK1正向引物5’-TGCAGCATGGCAGCTATTATC-3’，反向引物5’-AGCATCAATACTCGACATGAACG-3’；JNK2正向引物5’-TGAAACTAAGCCGTCCTTTTCAGA-3’，反向引物5’-TTCCAG CTCCATGTGAATAACCT-3’；NLRP3正向引物5’-CGTGAGTC CCATTAAGATGGAGT-3’，反向引物5’-CCCGACAGTGGATAT AGAACAGA-3’；caspase-1正向引物5’-TTTCCGCAAGGTT CGATTTTCA-3’，反向引物5’-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3’；ASC正向引物5’-TGGATGCTCTGTACGGGAAG-3’，反向引物5’-CCAGGCTGGTGTGAAACTGAA-3’；IL-1β正向引物5’-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3’，反向引物5’-CGTTATCC CATGTGTCGAAGAA-3’；β-actin正向引物5’-GACATCCG CAAAGACCTG-3’，反向引物5’-GGAAGGTGGACAGCGAG-3’。RT-PCR檢測采用SYBR Green熒光染料法。計算出目的基因mRNA相對定量的表達量。每組均設3個重復孔，最終結果取3次的平均值。

1.2.4 caspase-1活性試劑盒測定caspase-1活性：取接種于6孔板的的HCECs，加入20 μmol/L JNK抑制劑SP600125預處理2 h后，給予500 mOsm的高滲液刺激，繼續培養6 h后，收集細胞備用。另設等滲組和高滲組，相同實驗重復3次。根據caspase-1活性檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 AOEB染色（吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色）檢測細胞凋亡情況：取接種于12孔板的HCECs，棄舊培養基，加入20 μmol/L JNK抑制劑預處理2h后，給予500 mOsm的高滲液刺激，繼續培養12 h后，按照說明書進行染色后拍片。

1.2.6 免疫熒光染色法檢測NLRP3和IL-1β蛋白表達情況：細胞消化爬片，加入20 μmol/L SP600125預處理2 h后，給予500 mOsm的高滲液刺激，繼續培養6 h后，細胞爬片用PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3遍，再用0.5% Triton-100打孔10 min，PBS洗3遍，然后用20%山羊血清37 ℃下封閉2 h，更換培養基，加NLRP3或IL-1β兔抗（1∶200）4 ℃過夜。PBS洗3遍，用熒光標記的二抗在37 ℃下避光孵育1 h。再用PBS洗3次，DAPI（1∶1 000用抗淬滅劑稀釋）染核，封片，置于室溫下晾干20 min后拍片。

1.2.7 Western blot檢測JNK、p-JNK、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達：取接種于6孔板的HCECs，棄舊培養基，加入20 μmol/L JNK抑制劑SP600125預處理2 h后，給予500 mOsm的高滲液刺激，繼續培養2 h后，收集細胞備用，來進行JNK、p-JNK蛋白水平檢測，培養6 h后，相同方法進行余下相關蛋白檢測。另外再設置等滲組和高滲組。相同實驗重復3次。Bradford法測定樣品總蛋白濃度，每組各取50 μg總蛋白樣品，以8%、10%或12%的分離膠SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h。將膜分別泡入兔抗JNK抗體（1∶1 000）、兔抗p-JNK抗體（1∶1 000）、兔抗NLRP3抗體（1∶1 000）、兔抗cas-pase-1抗體（1∶10 000）、兔抗ASC抗體（1∶10 000）和兔抗GAPDH抗體（1∶5 000）中，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后加山羊抗兔HRP標記的二抗（1∶3 000稀釋），常溫孵育1 h，TBST洗膜次。用ECL發光液標記然后分析。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 6軟件進行數據圖表繪制和統計學分析。計量資料以 ±s表示，采用單因素方差分析進行多組比較，兩兩比較采用Tukey法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 應用JNK抑制劑抑制JNK可下調炎癥小體和炎癥因子mRNA的表達 經過20 μmol/L JNK抑制劑SP600125預處理的HCECs，細胞內的JNK表達被抑制，通過檢測炎癥小體和炎癥因子的表達，說明JNK在本細胞高滲模型中所起的作用。RT-PCR檢測結果顯示，與等滲組相比，高滲組HCECs內JNK1、JNK2、NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6的mRNA表達量均顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。與高滲組比，高滲+JNK抑制劑組HCECs內JNK1、JNK2、NLRP3、caspase-1和IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6 mRNA表達量顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），而ASC差異無統計學意義（P=0.431）。見圖1。

2.2 JNK抑制劑抑制高滲透壓對HCECs中caspsase-1活性的影響 caspase-1活性測定結果顯示，與等滲組比，高滲組HCECs內caspase-1活性明顯上升，差異有統計學意義（P=0.020）。而與高滲組比，高滲+JNK抑制劑組中caspase-1活性下降，差異有統計學意義（P＜0.001），說明JNK抑制劑SP600125也能夠抑制高滲透壓對caspase-1的激活。見圖2。

圖1 3組HCECs中JNK1、JNK2、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-6的mRNA相對表達量

圖2 3組HCECs中caspase-1活性的變化

2.3 JNK抑制劑緩解高滲透壓引起的HCECs細胞凋亡 用AOEB染色檢測高滲刺激以及是否有SP600125預處理的細胞凋亡情況，結果表明，在500 mOsm高滲刺激12 h后，細胞內的紅色熒光顯著增強，說明高滲可以引起HCECs的凋亡。SP600125預處理后，紅色的熒光明顯減弱，提示JNK抑制劑能夠緩解高滲引起的細胞凋亡。見圖3。

圖3 3組HCECs凋亡情況（AOEB染色，×10）

2.4 JNK抑制劑抑制高滲引起的HCECs中NLRP3和IL-1β蛋白的過表達 如圖4所示，藍色熒光為視野下所有由DAPI染色的細胞核，綠色熒光為被染色的NLRP3和IL-1β蛋白。高滲刺激6 h后NLRP3和IL-1β的蛋白表達水平明顯上升。SP600125預處理后，NLRP3和IL-1β的蛋白表水平明顯降低。結果提示JNK抑制劑通過抑制JNK下調NLRP3和炎癥因子IL-1β的表達。

圖4 3組HCECs中NLRP3和IL-1β蛋白表達（免疫熒光，×40）

2.5 JNK抑制劑抑制高滲引起的HCECs中p-JNK、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的過表達 與等滲組比，高滲組在500 mOsm高滲刺激2 h后HCECs JNK表達量無明顯變化（P=0.795），p-JNK表達量顯著上升（P=0.024），刺激6 h后，NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表達量顯著上升（P＜0.01）。而與高滲組比，高滲+JNK抑制劑組JNK表達量無明顯變化，p-JNK、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白表達量顯著下降（P＜0.05），ASC則無明顯變化（P＞0.05）。見圖5。結果進一步提示JNK抑制劑通過抑制JNK下調NLRP3炎癥小體的表達，從而降低炎癥因子IL-1β的表達，且JNK對后續因子的調控是通過JNK磷酸化進行的。

3 討論

本研究利用高滲刺激HCECs的干眼體外細胞模型，進一步研究ROS-NLRP3-IL-1β這一信號通路。通過JNK抑制劑來探究JNK在這一通路中的作用，提示JNK通過其磷酸化作用連接ROS和NLRP3-IL-1β通路。

圖5 3組HCECs中p-JNK、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表達量

目前已有大量研究證實，高滲透壓刺激能誘發各種組織細胞，包括腎細胞、心肌細胞、肝細胞、角膜上皮細胞等ROS的生成驟增，隨后啟動細胞的多條信號通路，從而誘導炎癥反應和細胞凋亡[7-9]。COPP等[10]在前人的基礎上研究發現，猴腎細胞在高滲刺激后，立即出現線粒體膜電位消失，不過這些現象具有可逆性，在高滲1 h后如果更換等滲培養液，分解的線粒體會在1 h內重新聚合并且完全恢復膜電位。說明高滲刺激是一種線粒體高度敏感的刺激信號，線粒體結構和功能隨高滲刺激的強度和時間做出不同的反應和相應的調整。本研究顯示HCECs的NLRP3和IL-1β的激活需在高滲刺激達到一定的滲透壓閾值才會出現，說明HCECs具有較強的抗氧化系統和滲透壓平衡系統，能夠抵御輕中程度的滲透壓升高。采用500 mOsm高滲透壓是依據本課題組之前的研究結果和相關文獻的報道而定[5，11]。我們曾做過小鼠干眼動物模型的體內實驗，證明用滲透壓保護劑左旋肉堿點眼能減輕干眼眼表炎癥反應和細胞凋亡[9]。有研究表明淚膜高滲是干眼發病的重要核心機制之一，它與眼表免疫炎癥反應和病理性細胞凋亡形成惡性循環，導致角膜屏障功能受損，共同促進干眼的發生和發展，為干眼病最主要的病理生理改變[12]。在本研究中，500 mOsm高滲誘導的干眼細胞模型中HCECs內JNK、NLRP3和炎癥因子IL-1β表達升高。說明JNK等表達于HCECs，且在滲透壓為500 mOsm時升高明顯。

近年來很多基礎研究發現JNK與多種疾病炎癥反應有關。葉黃素抑制高滲誘導的HCECs IL-6的分泌，這是由于p38、JNK和NF-κB通路失活而發生[13]。在LPS/D-Gal所致的肝炎中AMPK可能是一個有害因素，它通過增強JNK活性所致的凋亡起作用[14]。慢性HIV-1感染中，miR-126-5p會通過p-JNK表達增強而增強LPS誘導的單核細胞炎癥反應[15]。五味子木脂素提取物通過調控NF-κB、JNK和Bcl-2/Bax通路，聯合抗氧化、抗炎、抗凋亡來減輕炎癥反應和細胞凋亡來防止CCl-4引起的肝損傷[16]。這些研究都說明JNK與炎癥反應的密切關系。我們發現在HCECs，通過特異性的JNK抑制劑SP600125來抑制高滲誘導的HCECs中JNK活性，檢測到炎癥因子IL-1β等的表達下降。該結果提示高滲誘導的HCECs炎癥因子IL-1β表達升高可能與JNK的活性相關。這與JNK在其他系統所致的炎癥反應一致。

諸多基礎研究發現，NLRP3與線粒體、ROS也存在著密切的聯系。細胞自體吞噬能力是保持線粒體結構和功能穩定的關鍵因素，通過對線粒體的影響來調控ROS的生成和NLRP3的激活[17-18]。ZHOU等[18]的研究結果也顯示，人巨噬細胞自吞噬功能被抑制后，線粒體受損且ROS不斷產生，繼而激活NLRP3炎癥小體。雖然目前已有大量的證據顯示NLRP3的激活與線粒體ROS的過度生成有直接相關性，但線粒體ROS介導NLRP3激活及炎癥小體形成的具體機制仍不明確。有研究闡述兔角膜上皮細胞ROS升高導致JNK炎癥反應信號通路和調控CD95/CD95L介導的細胞凋亡[19]。迄今為止，JNK與NLRP3炎癥小體之間的關系仍不是十分清楚。我們通過JNK抑制劑來抑制高滲誘導的HCECs中JNK的活性，檢測到炎癥小體聚合成分NLRP3、caspase-1以及炎癥因子IL-1β的mRNA表達下降，而ASC的表達與是否使用JNK抑制劑沒有明顯關系，Western blot結果中ASC的蛋白表達變化也未出現相關變化，NLRP3、caspase-1以及炎癥因子IL-1β蛋白變化與mRNA變化一致，提示高滲誘導的HCECs中NLRP3炎癥小體和炎癥因子IL-1β表達的升高與JNK相關，免疫熒光的結果也與之相符。而JNK對IL-1β的調控是通過NLRP3、caspase-1進行的，與其聚合成分ASC沒有明顯關系。本研究發現，3組p-JNK蛋白發生了明顯變化，而JNK蛋白本身基本無變化，這說明JNK是通過其磷酸化而作用的。

利用JNK抑制劑可以有效降低NLRP3炎癥小體和炎癥介質IL-1β等的分泌，這提示JNK抑制劑很可能成為針對IL-1β相關炎癥疾病的治療藥物。由于JNK不僅在激活炎癥因子的通路上起到重要的作用，它也能通過caspase-1的活化而導致細胞死亡，故直接抑制JNK的活性，其效果會優于目前已用于臨床的IL-1β抑制劑，這對炎癥性疾病的治療意義重大。由于滲透壓升高會通過JNK介導的途徑導致角化蛋白產生增多和細胞活性減少，抑制JNK產生會下調由于高滲所致的人原代角膜上皮細胞的角化作用，這對預防角膜上皮角化干眼癥有潛在治療意義[20]。另外抑制p38/MAPK途徑可能是輻射所致淚腺損傷的有效治療措施[21]。這些都說明以JNK為靶點治療角膜疾病具有重大意義。

綜上所述，高滲刺激引起HCECs中JNK磷酸化增強和炎癥小體聚合成分NLRP3、cas-pase-1和炎癥因子IL-1β的表達均明顯增高，抑制JNK活性可以下調它們的表達，提示JNK對NLRP3介導的炎癥反應具有調控作用。高滲引起HCECs JNK磷酸化增強后，它通過什么途徑影響NLRP3炎癥小體表達的變化、炎癥因子表達和細胞凋亡還有待深入研究，但NLRP3激活與JNK的相關性已經確定，也為后續臨床相關的研究做了必要的方向性指示。