豁痰解毒通絡飲干預NF—κB/ERK信號通路參與球囊損傷后大鼠頸動脈內膜增生的機制研究

沈娟娟+鄧悅+路方平+馬金玲+田野+王聞靖+張冰銳

【摘要】目的 研究觀察豁痰解毒通絡方對頸動脈球囊損傷術后再狹窄大鼠，主動脈平滑肌細胞增生信號通路的調控機制和相關指標。方法 采用SD大鼠建立大鼠頸動脈球囊損傷動物模型；隨機分為假手術組、模型組、豁痰解毒通絡組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡組+辛伐他汀組。采用免疫組化法檢測大鼠頸動脈組織ERK、NF-κB蛋白的表達。結果 免疫組化染色結果提示：假手術組無陽性著色。模型組可見較多棕黃色細胞核。豁痰解毒通絡組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡+辛伐他汀組陽性著色與模型組比較顯著改善。結論 豁痰解毒通絡飲可以有效抑制大鼠頸動脈球囊損傷后新生內膜的增殖，可能通過抑制ERK1/2、NF-κB信號通路來抑制新生內膜的增殖。

【關鍵詞】豁痰解毒通絡；PTCA術后再狹窄；血管重構；細胞增殖

【中圖分類號】R28 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2017.32..02

心血管疾病目前已成為威脅人類健康與生命的頭號殺手，其發病率和死亡率超過腫瘤性疾病躍居第一[1]。經皮冠狀動脈腔內血管成形術（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后再狹窄（restenosis，RS）是影響冠狀動脈粥樣硬化性心臟病介入治療預后的關鍵問題，嚴重制約了經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的遠期療效，成為心血管領域的研究熱點和難點[2]。隨著對 RS 分子水平機理研究的不斷深入，發現許多因素如細胞因子、生長因子等可通過活化細胞外信號調節氨基末端蛋白激酶（JNK）、p38 絲裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路影響細胞周期蛋白及凋亡相關基因，在 VSMC 增殖、分化、凋亡以及轉移中發揮重要的調控作用[3-4]。針對PTCA后再狹窄，VSMC 增殖與凋亡調控因素的干預是 RS 防治的切入點。近年來，中醫藥防治PTCA后再狹窄的研究漸趨活躍。中藥具有穩定性好，毒副作用小等特點，己經越來越受到人們關注。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠60只，50日齡，重量（350±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 藥品與試劑

中藥：豁痰解毒通絡飲：雙花，當歸，甘松，丹參等藥物組成。生藥由長春中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供，含生藥量為2.33 g/mL。辛伐他汀片（遠大醫藥中國有限公司，批號：H20000107，規格：5 mg）。

1.1.3 實驗儀器

迷你轉印電泳儀（北京鼎國昌盛生物有限公司，DYCZ-24D）；低速水平離心機 （湖南相依離心機儀器有限公司，L-550）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備

大鼠適應性喂養7天。術前背部皮下注射低分子肝素鈉注射液，預防急性血栓形成，劑量為500 U/kg。注射1 h后進行造模。腹腔麻醉大鼠。固定大鼠取正中切口，分離并且暫時阻斷左頸總動脈、左側頸外動脈、左側頸內動脈。結扎小分支。在左頸總動脈近心端采用動脈夾暫時阻斷后，于頸內動脈遠心端用眼科剪一小切口，在導絲引導下插入3.0×15 mmRunjin球囊導管，迅速插入球囊導管，緩慢伸至頸總動脈近心端處，導管插入深度約4 cm，采用醫用球囊擴張壓力泵（l～2 atm）充盈球囊，以生理鹽水充盈球囊（壓力0.6～0.8 atm），持續30 s后，使球囊膨脹至回拉時有較明顯的阻力感，保持阻力一致緩慢向遠心端旋轉回拉，球囊至頸總動脈分叉處，將球囊泄壓至0 atm，再次重復以上步驟，反復操作3次。撤出球囊后，迅速結扎左側頸外動脈，開通頸內動脈和頸總動脈血運循環，分層縫合頸部傷口。術后腹腔注射青霉素抗炎，背部皮下注射低分子肝素鈉注射液抗凝3天。假手術組大鼠只分離并結扎左側頸外動脈，不做球囊拉傷處理。

1.2.2 分組給藥

于術后第2天起連續灌胃30天。假手術組、模型組灌胃等量蒸溜水，豁痰解毒通絡組灌胃豁痰解毒通絡方1.633 g/mL。辛伐他汀組灌胃辛伐他汀0.119 mg/mL。豁痰解毒通絡方+辛伐他汀組灌胃豁痰解毒通絡方1.633 g/mL及辛伐他汀0.119 mg/mL。每日1次，給藥30天。

1.2.3 免疫組化染色法檢測大鼠頸動脈ERK、NF-kB的表達

常規脫蠟至水洗，檸檬酸鹽熱修復，然后室溫冷卻；清洗；滴加阻斷劑，清洗；加封閉液；滴加一抗（ERK抗體效價1：100、NF-κB抗體效價1：100），4℃靜置過夜；清洗；滴加生物素標記的抗鼠/兔IgG的第二抗體，清洗；滴加辣根過氧化酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白，清洗；滴加顯色劑，光鏡下觀察，顯色適當用水終止；Mayer蘇木素復，蒸餾水沖洗；弱氨水返藍，蒸餾水沖洗；脫水、透明、中性樹膠封片。

1.3 統計學軟件

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，計數資料以百分數（%），例（n）表示，采用x2檢驗；計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化染色法檢測大鼠頸動脈NF-κB的表達

NF-κB通常狀況下存在于胞漿，活化后進入核內，免疫組化染色陽性細胞表現為胞核呈棕黃色，并可見棕黃色顆粒沉積。假手術組無陽性著色。球囊損傷術后30天模型組和假手術組可見血管壁新生內膜細胞較多棕黃色細胞核。豁痰解毒通絡組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡+辛伐他汀組陽性著色與模型組比較顯著改善。

2.2 免疫組化染色法檢測大鼠頸動脈ERK的表達endprint

p-ERK通常狀況下存在于胞質，活化后進入核內，免疫組化染色陽性細胞表現為胞核呈棕黃色，并可見棕黃色顆粒沉積。假手術組無陽性著色。球囊損傷術后 30 天模型組和假手術組可見明顯棕黃色細胞核。豁痰解毒通絡組、辛伐他汀組、豁痰解毒通絡+辛伐他汀組陽性著色與模型組比較顯著改善。

3 討 論

由于球囊反復、持續對血管壁進行刺激，受累血管壁細胞不斷激活炎性等刺激因子逐漸形成慢性炎癥。由于刺激因子持續存在，在其長期刺激引導下炎性因子表達增高[5]。在其外力持續刺激下血管平滑肌細胞增殖、遷移，致內膜不斷增生，進一步血管重塑形成血管再狹窄。

在慢性炎癥過程中，損傷的血管平滑肌細胞可釋放大量活性物質，這與中醫所述病理性津液滯留所致“痰”的理論一致[6]。而慢性炎癥過程中血小板黏附、聚集及血栓的產生、纖維斑塊及結締組織的形成、單核細胞轉變為泡沫細胞在內皮下的沉積、血液粘稠度增高等現象，又符合中醫“瘀”的具體表現[7]。中醫認為，“痰”與“瘀”常共同致病，痰瘀互結，蘊結成毒，“毒”損脈絡，加重血管的損傷。

我們根據現代醫學對RS發生發展的新認識，以“伏邪多與痰瘀相關”為突破口，提出“痰瘀互結，毒損心絡可能是PTCA術后再狹窄主要機制”假說。治療應以“豁痰解毒，化瘀通絡”為治療原則。探討豁痰解毒通絡飲干預RS后內膜增生的作用機制，從而達到防治血管再狹窄目的。因此，我們確立以“痰瘀互結，毒損心絡”為切入點，以豁痰解毒，化瘀通絡為治療原則，探討中藥復方通過干預炎癥反應防治RS的作用機制。對明確了解中醫藥干預RS其作用機制奠定了理論基礎。

參考文獻

[1] Williams DO，Holvbkov R，Yeh W，et al.Percutaneous coronary intervention in the current era compared with 1985-1986 the National Heart，Lung，and Blood Institute Registries[J].Circulation，2000，102（24）：2945-2951.

[2] Rensing BJ，Harmans WR，Decker JWL.Uminal renarrowing after percutaneous translu minal coronary angloplasty followinggaussian distributin.A quantitative anglographic study in 1445 successfully delated lesions[J].Am J Cardiol.1992，19（6）： 939-945.

[3] Suc I，EscargeuilBlanc I，Truly Met a1.HDL and apoA prevent cell death of endothelial cells induced by oxidized LDL[J].Arterloscler ThrombVasc Biol，1997，17（8）：2158-2166.

[4] Cassells W， Engler D， wllenson j，et a1.Mechanism of restenosis[J].Tex Heart Last ，1994，21（8）：68-77.

[5] New G，Moses JW，Roub in GS， et a1.Estrogenaeluting， phosphory choline-coated stent implantation is associated with reduced neointimal form ation but no delay in vascular repair in a porcine coronary model[J].Catheter Cardiovasc Interv，2002，57（5）：266-271.

[6] 魯明源.冠心病化痰濁飲治法溯源與述評[J].山東中醫藥大學學報，2007，31（2）：31-33.

[7] 雷 燕，黃啟福，王永炎.論疲毒阻絡是絡病形成的病理基礎[J].北京中醫藥大學學報，1999，2（2）：1-5.

[8] 程小曲.痰濁型冠心病與血脂，脂蛋白，載脂蛋白的關系及痰濁形成機理的討論[J].新中醫，994，（3）：7-10.

本文編輯：李 豆endprint