胃蛋白酶法提取魚(yú)腥草多糖工藝研究

杜晶　汪珊　黃傳輝

【摘 要】目的：優(yōu)化胃蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的制備工藝。方法 以多糖含量和多糖得率為指標(biāo)，才用正交試驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果及結(jié)論：最佳工藝條件為溫度50℃，pH=7，酶加入量5.0%，提取時(shí)間1.5h。魚(yú)腥草為三白草科 Saururaceae 蕺菜屬植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的新鮮全草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，主要用于肺膿瘍、痰熱咳嗽、熱痢熱淋、癰瘡腫毒[1]。其水溶性多糖對(duì)羥自由基和超氧自由基有較明顯的清除作用[2]。但目前胃蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的工藝尚未報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)以多糖的率及含量為指標(biāo)[3]，采用正交試驗(yàn)對(duì)魚(yú)腥草多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2018）01--01

1 儀器與試藥

UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；SHB3循環(huán)水真空泵（上海申生科技有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空機(jī)（鞏義市英峪予華有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市宏華試劑廠）；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、AY120電子天平（日本島津）。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司）；胃蛋白酶（1：3000，批號(hào)081110 廣州市齊云生物生產(chǎn)）；苯酚、濃硫酸、氨水、95%乙醇均為分析純，苯酚試液（自配[4]）

干品魚(yú)腥草購(gòu)于廣州清平市場(chǎng)，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥鑒定教研室姬生國(guó)博士鑒定為三白草科蕺菜屬植物Houttuynia cordata Thunb.。

2 方法與結(jié)果

2.1 魚(yú)腥草多糖的提取 稱(chēng)取魚(yú)腥草藥材5.0g，按正交設(shè)計(jì)表?xiàng)l件進(jìn)行提取，按照正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，提取液濃縮至1：4（原料重：溶液體積），80%乙醇醇沉，靜置2小時(shí)以上，抽濾，取沉淀，50度烘箱里烘干，得粗多糖[5]。

2.2 魚(yú)腥草多糖含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.0994g ，加水溶解并定容至 100mL，移取1ml，加水定容至10ml容量瓶中，即得濃度為0.0994mg/mL的葡萄糖對(duì)照品貯備液。

2.2.2 供試液的制備：稱(chēng)取魚(yú)腥草藥材5.2g，按照正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取，得粗多糖。精密稱(chēng)取于50℃烘干至衡重的粗多糖100mg，加水溶解并定容至50ml，搖勻，再取1mL定容至10mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：精稱(chēng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，置10mL容量瓶中加水至刻度線(xiàn)，搖勻，再分別取1mL，加適量苯酚溶液及濃硫酸顯色45min。置分光光度計(jì)中，于490nm測(cè)定吸收度，以吸收度（A）對(duì)葡萄糖含量（C）進(jìn)行回歸，得回歸方程：A=8.4286C-0.0258 ，相關(guān)系數(shù)γ=0.9969。結(jié)果表明葡萄糖在0.0192～0.0596mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.4 多糖含量的測(cè)定：取供試品溶液1mL，置于試管中，加適量苯酚及濃硫酸，振搖均勻，顯色45min。另取1mL 蒸餾水 ，加同量苯酚和濃硫酸 ，同法操作 ，作為空白對(duì)照。置UV-2450型分光光度計(jì)中 ，于490nm測(cè)定吸收度。

2.2.5 多糖提取得率：稱(chēng)取魚(yú)腥草藥材5.2g，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行提取，得粗多糖。多糖得率=100%*（粗多糖的量/藥材的量）。

2.2.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：稱(chēng)取魚(yú)腥草藥材5.2g，按正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取，得粗多糖。精密稱(chēng)取于50℃烘干至衡重的粗多糖0.1000g，加水溶解并定容至50mL，搖勻。以蒸餾水為空白對(duì)照，于分光光度計(jì)中測(cè)定280nm、260nm處吸收度。根據(jù)公式求出蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45D280-0.74D260[6]

2.3 胃蛋白酶提取最佳條件優(yōu)選 影響酶法提取多糖的因素主要有酶添加量、pH值、溫度、時(shí)間等[7]，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以pH=7，以40倍魚(yú)腥草藥材體積水提取多糖，對(duì)酶添加量、溫度、時(shí)間等因素采用L9（34）正交試驗(yàn)法確定胃蛋白酶最佳提取條件。最佳提取條件要滿(mǎn)足多糖提取率高級(jí)含量高，因此我們采用加權(quán)評(píng)分法綜合評(píng)價(jià)魚(yú)腥草多糖的提取條件。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：將各項(xiàng)指標(biāo)除以該列最大值再乘以100，通過(guò)處理，多糖的率和多糖含量都在0至100之間。根據(jù)多糖得率（x）和多糖含量（y）的作用，而確定二者的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.6對(duì)兩項(xiàng)指標(biāo)得分的加權(quán)求和，通過(guò)公式z=0.4x+0.6y，得到綜合評(píng)分（z）.由正交試驗(yàn)及方差結(jié)果表明，胃蛋白酶提取多糖的影響因素大小順序?yàn)椋篈>C>B，最佳提取條件為：A3B3C3，即ph=7，溫度50℃，酶加入量5.0%，提取時(shí)間1.5h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按胰蛋白酶5.0%，40倍體積在pH=7，50℃溫浸1.5小時(shí)的方法提取三次，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。魚(yú)腥草多糖得率分別為9.52%、9.90%、9.60%，RSD%=0.20。魚(yú)腥草多糖含量分別為20.41%、22.45%、20.79%，RSD%=1.08%。表明重現(xiàn)性良好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，最終確定了胃蛋白酶最佳提取魚(yú)腥草多糖的工藝條件為以40倍藥材體積水，在pH=7，溫度50℃，酶加入量5.0%，提取時(shí)間1.5h。該工藝既保證了得率還提高了含量，為魚(yú)腥草進(jìn)一步研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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