單純皰疹病毒型和型核酸擴增試劑盒反應體系的優化

吳穎瑩

【摘 要】目的：優化單純皰疹病毒1型和2型核酸擴增試劑盒PCR反應體系，提高其靈敏度；方法：在PCR反應基礎液配方的基礎上，分別對擴增條件和反應體系中主要成分的濃度進行了優化反應參數進行擴增，經SLAN-96P熒光定量PCR儀，測定熒光強度；結果：確定了PCR反應體系的擴增條件以及主要成分的濃度比例；結論：本研究所確定的PCR反應體系靈敏度高專屬性好。

【關鍵詞】皰疹病毒1型；皰疹病毒2型；PCR優化

Optimization of reaction system of herpes simplex virus type 1 and 2 nucleic acid amplification test kit

[Abstract] Objective：To optimize the herpes simplex virus type 1 and 2 PCR reaction system， and to obtain a more efficient and sensitive kit. Methods：Based on the formula of PCR reaction base fluid， optimize the amplification conditions and the concentration of main components in the reaction system， and amplify the reaction parameters. The fluorescence intensity was determined by SLAN-96P fluorescence quantitative PCR. Results：Determine the amplification conditions of the PCR reaction system and the concentration ratio of the main components. Conclusion：The sensitivity and specificity of the PCR reaction system determined by this study are good.

[Key words] herpes virus type 1， herpes virus type 2， PCR， optimization

【中圖分類號】R545.14 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）01-00-01

單純皰疹病毒（Herpse simplex virus， HSV）是一類嚴重危害人類健康、引起皮膚病、性病等疾病的常見病原體。HSV是有包膜的雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒科，分為HSV-1和HSV-2兩個血清型[1]。我國的HSV感染發病率迅速上升，近年HSV-1型的感染顯著增多，因此需要對單純皰疹病毒感染進行快速靈敏準確的診斷。隨著現代核酸技術的發展，建立在基因水平上的核酸擴增技術（PCR）由于其高敏感性和高特異性在單純皰疹病毒的臨床檢測中得到廣泛應用[2]。單純皰疹病毒1型和2型核酸擴增雙檢試劑盒（PCR-熒光探針法）是檢測單純皰疹病毒1型和2型的一種熒光定量PCR檢測試劑。它采用了高靈敏的TaqMan分子探針，使特異性和靈敏度顯著提高，直接探測PCR過程中熒光信號的變化。檢測過程中反應體系全封閉、靈敏度高、特異性強，為臨床上各種皰疹的早期診斷提供分子生物學上的參考依據[3]。試劑盒由PCR反應液、陰性質控品、陽性質控品、內標模板、RNA提取液等組成。為了得到更高效靈敏的試劑盒，本研究對試劑盒PCR反應體系的主要組分及反應條件進行了優化，使其擴增達到更好的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

滅菌水，生理鹽水，Taq 酶及PCR Buffer、dNTPs購自TaKaRa公司，單純皰疹病毒1型引物、探針序列為5'-AACCACCAAGGAGCTCAAGAAC-3'；與5-（ROX）-CCACCAACCCGGACGCGTCC-（BHQ1）-3。單純皰疹病毒2型引物、探針序列為5'-GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3'與5-（ FAM）-CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-（ BHQ1） -3均購自生工生物工程（上海）有限公司，純度99%；TaqMan探針購自生工生物工程（上海）有限公司，純度99%。美國Stratagene實時熒光定量PCR儀SLAN-96P。

1.2 方法

1.2.1 擴增條件的優化設計：采用2步擴增法，變性溫度和時間設為預變性95℃，3min，變性95℃，10s。依據引物及探針的理論Tm的計算，同時根據擴增的熒光信號及擴增的Ct比較擴增的效果，退火溫度分別設置為56℃，58℃，60℃反應1分鐘，40個循環，按表1 加入各反應組分及模板，離心分裝后置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號[4][5]。

1.2.2 HSV1引物濃度的優化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，純化水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，改變加入PCR反應管中的引物量，設置HSV1引物濃度分別為0.20、0.30、0.40、0.50、0.60μM的5個濃度梯度。分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

1.2.3 HSV1探針濃度的優化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，滅菌雙蒸水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，通過改變加入PCR反應管中的HSV1探針的量，設置HSV1探針濃度分別為0.12、0.16、0.20、0.24、0.28μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

1.2.4 HSV2引物濃度的優化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，純化水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，改變加入PCR反應管中的引物量，設置HSV2引物濃度分別為0.20、0.30、0.40、0.50、0.60μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作收集熒光信號endprint

1.2.5 HSV2探針濃度的優化：以HSV1&2抽提的DNA作為模板，滅菌雙蒸水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，通過改變加入PCR反應管中的探針的量，設置HSV2探針濃度分別為0.12、0.16、0.20、0.24、0.28μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

1.2.6 內標引物濃度的優化：以HSV1抽提的DNA作為模板，純化水作為空白對照，在固定其它組分濃度的前提下，改變加入PCR反應管中的內標引物量，設置內標引物濃度分別為0.06、0.08、0.10、0.12、0.14μM的5個濃度梯度，分別置于PCR儀中，依法操作，收集熒光信號

2 結果

2.1 反應條件優化結果見圖1-圖3，曲線虛線表示HSV1擴增曲線，實線表示HSV2擴增曲線，點劃線表示內標擴增曲線。由圖可以看出，三種反應條件中，第三種得到的熒光信號強，且曲線呈S型，因此本實驗選擇最佳退火溫度為60℃。并最終確定的反應條件為：50℃ 2分鐘；95℃ 3分鐘；95℃ 10秒、60℃ 1分鐘，40個循環。

2.2 在PCR反應基礎液配方的基礎上，本研究分別對反應體系中主要成分的濃度進行了優化反應參數進行擴增，經SLAN-96P熒光定量PCR儀上機后，實驗結果如圖4-圖8所示：

由圖4和圖6可知隨著HSV1和HSV2引物濃度的增高，Ct值基本一致。當HSV1和HSV2引物濃度為0.40μM時，反應結束后的熒光信號強度最高，確定HSV1和HSV2引物的濃度均為0.40μM。由圖5和圖7所知，5種不同濃度的HSV1和HSV2探針進行PCR擴增，當探針的濃度為0.20μM時，反應結束后的熒光信號強度最強，本實驗確定的最佳HSV1和HSV2探針濃度均為0.20μM。由圖8可以看出，隨著引物濃度的增高，Ct值基本一致。當內標引物為0.10μM時，內標擴增曲線呈S型，且熒光信號強度較強。最終確定內標引物的濃度為0.10μM。

3 討論

在本項研究中，單純皰疹病毒1型的TaqMan探針的基團設計為ROX，ROX的吸收光波長為575 nm，發射光波長為602 nm。單純皰疹病毒2型的TapMan探針的基團設計為FAM，FAM的吸收光波長為494nm，發射光波長為525nm，因此彼此不會相互干擾。

本研究基于TaqMan探針技術與實時熒光PCR儀的結合，對實時熒光PCR反應體系中主要組分用量及濃度進行了優化并得到最佳處方；在退火溫度上進行了梯度試驗摸索，退火溫度設置為60℃，退火時間設置為1min，依次反復試驗，從而使HSV1的檢測均能在同一應條件下進擴增而達到較好的效果。本試劑盒經反應體系的優化后，檢測更佳高效，靈敏度更好。

參考文獻

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