黑龍江馬鈴薯黑痣病菌生物學(xué)特性及菌絲融合群的鑒定

牟明　趙偉　楊明秀　宋爽　張俊華

摘要：采用生長(zhǎng)速度法研究了黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長(zhǎng)的條件、黑痣病菌的生物學(xué)特性及菌絲融合群情況，為病害的防治提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，黑痣病病菌菌絲的適宜生長(zhǎng)條件為25～30℃，低溫情況下生長(zhǎng)速度緩慢且在5℃不生長(zhǎng)；最適合生長(zhǎng)的pH值為7；黑暗環(huán)境更適合黑痣病病菌的生長(zhǎng)；在本試驗(yàn)的幾種碳源中，最利于病菌生長(zhǎng)的是可溶性淀粉，在本試驗(yàn)的幾種氮源中，最有利于病菌生長(zhǎng)的是酵母粉。從黑龍江省7個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集馬鈴薯黑痣病樣品100份，融合群測(cè)定結(jié)果表明，這些菌株分別屬于AG-8、AG-6、AG-5、AG-4、AG-1-IC、AG-3和AG-1-IA融合群，其中AG-1-IA群有8個(gè)菌株，AG-1-IC群有13個(gè)菌株，AG-3群有10個(gè)菌株，AG-4群有20個(gè)菌株，AG-5群有17個(gè)菌株，AG-6群有10個(gè)菌株，AG-8群有14個(gè)菌株，其中AG-4為優(yōu)勢(shì)菌群。黑龍江省的馬鈴薯黑痣病菌融合群分布比較復(fù)雜，同一地點(diǎn)可能出現(xiàn)不同的融合群，同一融合群也會(huì)在不同的地區(qū)出現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；立枯絲核菌；生物學(xué)特性；菌絲融合群

馬鈴薯黑痣病是一種非常嚴(yán)重的土傳病害，主要是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）所引起，在馬鈴薯塊莖及土壤中越冬存活。馬鈴薯黑痣病發(fā)病區(qū)域非常廣泛，在世界各地均有發(fā)生。據(jù)報(bào)道，AG-3是立枯絲核菌主要的融合群，常常引起黑脛病、莖腐或匍匐莖腐爛，而AG-1、AG-2、AG-4、AG-5和AG-7等融合群也有相關(guān)研究報(bào)道。AG-2型病原菌存在3種基因型，其中AG-2-1550 bp的致病性是最強(qiáng)的，是導(dǎo)致匍匐莖和莖壞死的主要基因型，另外2個(gè)基因型的致病性較弱，僅會(huì)導(dǎo)致較小的病斑，而AG-3型病原菌主要對(duì)匍匐莖、塊莖及莖進(jìn)行侵染，致病能力很強(qiáng)。在田間試驗(yàn)和培養(yǎng)基中對(duì)塊莖的檢測(cè)都表明AG-3型病原菌其菌核的數(shù)量多于AG-2和AG-5型病原菌。AG-8型病原菌卻只有對(duì)根部的侵染能力，對(duì)植株其他部位不具備侵染能力，而AG-7型病原菌卻與之相反，不能侵染根部。生物學(xué)特性方面，李乾坤等對(duì)甘肅省馬鈴薯種植區(qū)采集的黑痣病菌菌株進(jìn)行分離，研究表明，菌絲生長(zhǎng)溫度最低為4℃，最適為23℃，34℃時(shí)停止生長(zhǎng)，劉寶玉等對(duì)內(nèi)蒙古馬鈴薯種植區(qū)的馬鈴薯黑痣病菌菌株進(jìn)行研究表明，菌絲生長(zhǎng)最高pH為11，在pH為12時(shí)停止生長(zhǎng)。

在黑龍江省，關(guān)于馬鈴薯黑痣病菌生物學(xué)特性的研究還比較少，融合群的鑒定分析研究接近空白，這使黑龍江省馬鈴薯黑痣病的防控缺少理論依據(jù)。筆者從黑龍江省7個(gè)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集分離得到100個(gè)馬鈴薯黑痣病菌菌株，通過對(duì)病菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究及菌絲融合群鑒定分析，為黑龍江省馬鈴薯黑痣病病害的發(fā)生及防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

2014-2015年從黑龍江克山、大慶、雙城、綏化、克東、呼蘭、黑河7個(gè)馬鈴薯種植區(qū)按種植面積的大小平均采集分離得到馬鈴薯黑痣病標(biāo)本100份。標(biāo)準(zhǔn)菌株AG-8、AG-6、AG-5、AG-4、AG-1-IC、AG-3和AG-1-IA由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2方法

1.2.1黑龍江馬鈴薯黑痣病菌生物學(xué)特性研究 從馬鈴薯塊莖上選取菌核，先放入酒精中消毒30s，再在HgCl₂中二次消毒2-3min，然后用無菌水沖洗，吸干表面水分后放人事先準(zhǔn)備好的PDA上，保證每個(gè)PDA板上有3～4塊菌核，培養(yǎng)溫度設(shè)置在25℃，培養(yǎng)1～2d，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取尖端的菌絲，繼續(xù)在PDA中純化培養(yǎng)，判斷立枯絲核菌的標(biāo)準(zhǔn)是有孢子、菌絲分枝或菌核的出現(xiàn)。確定是立枯絲核菌后，4℃保存在PDA斜面上備用。

將全部活化后的供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)，待培養(yǎng)基長(zhǎng)滿菌絲后，用5mm的打孔器沿著培養(yǎng)基最外圈的菌絲進(jìn)行打孔，然后將所得的所有菌碟轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基的正中心位置培養(yǎng)，處理36h后利用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑。

設(shè)置5、10、15、20、25、30、35℃共7個(gè)處理，3次重復(fù)，研究溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

設(shè)置連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12h光暗交替3個(gè)處理，3次重復(fù)，研究光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

得到菌碟后分別用1mol·L^-1HCL和NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，將菌碟分別放置在pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10種培養(yǎng)基中，25℃恒溫倒置培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，研究pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

查氏培養(yǎng)基：2g KNO₃，1g KH₂PO₄，0.5g KCl，0.01g FeSO₄，0.5g MgsO₄·7H₂O，20g瓊脂，30g蔗糖，1000g蒸餾水。將以下4種碳源替代蔗糖，供試碳源：麥芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖，以不加碳源作為對(duì)照；將以下4種氮源替代KNO₃，供試氮源：酵母粉、尿素、蛋白質(zhì)、硝酸鈉，以不加氮源作為對(duì)照。分別設(shè)置5個(gè)處理，3次重復(fù)，將菌碟接種于不同碳源培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，研究不同碳源、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.2菌絲融合群鑒定 利用載玻片配對(duì)法將供試菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的融合反應(yīng)做鑒定試驗(yàn)，操作如下：首先，將事先準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)菌株和待測(cè)菌株25℃恒溫處理72h，然后利用打孔器選取5mm的菌落，在滅菌的載玻片上用移液槍打一層PDA培養(yǎng)基，將標(biāo)準(zhǔn)菌株放置在載玻片的中間，待測(cè)菌株放在標(biāo)準(zhǔn)菌株的兩側(cè)，間隔1.5-2.0cm，然后將該載玻片放入無菌培養(yǎng)皿加無菌水，25℃恒溫培養(yǎng)24～36h，直到2種菌株邊緣生長(zhǎng)到一起并且交叉5mm左右時(shí)，利用顯微鏡觀察菌絲融合的情況，3次重復(fù)。分3種情況進(jìn)行鑒定，如表1所示。

2結(jié)果與分析endprint

2.1黑龍江馬鈴薯黑痣病菌生物學(xué)特性

2.1.1溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病菌菌絲在不同培養(yǎng)溫度下菌落生長(zhǎng)速度不同，其中5℃條件下不生長(zhǎng)、10～35℃條件下可以生長(zhǎng)，且在10～30℃之間菌落直徑隨溫度的升高明顯增大，在30℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)溫度大于30℃時(shí)菌落直徑隨著溫度的升高明顯變小。因此，25～30℃的培養(yǎng)條件利于黑痣病菌生長(zhǎng)，30℃是其最適培養(yǎng)溫度。多重比較結(jié)果表明，菌株在不同溫度處理間，菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著（圖1）。

2.1.2光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 對(duì)供試菌株病菌菌絲進(jìn)行全光照、全黑暗、光暗交替處理，結(jié)果表明，全黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌落平均直徑為75.8mm；光暗交替條件下生長(zhǎng)速度次之，菌落平均直徑為71.8mm；在全光照條件下生長(zhǎng)速度最慢；多重比較結(jié)果表明，全黑暗與光暗交替處理間差異不顯著，但與全光照處理間差異顯著（圖2）。

2.1.3不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 病菌菌絲的生長(zhǎng)在不同pH條件下速度不同，pH在3～12范圍內(nèi)馬鈴薯黑痣病菌菌絲均可生長(zhǎng)，其中菌絲的生長(zhǎng)速度較快的pH范圍為5～8，且在pH=7時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，pH=12時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最慢。多重比較結(jié)果表明，pH=3和pH=4、pH=5和pH=8處理間的菌絲生長(zhǎng)速度差異不顯著，其余各pH處理間菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著（圖3）。

2.1.4不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表2可知，病菌在供試的5種碳源中均可生長(zhǎng)，其中，在可溶性淀粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落直徑最大，蔗糖其次，而在果糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落直徑最小。

2.1.5不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3可知，病菌在所提供的5種氮源中均可生長(zhǎng)，其中，在酵母粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落直徑最大，蛋白胨培養(yǎng)基其次，而在尿素培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)效果最差。

2.2黑龍江馬鈴薯黑痣病菌融合群鑒定

2.2.1菌絲融合觀察 對(duì)菌絲融合進(jìn)行觀察是很直觀的檢測(cè)融合結(jié)果的方法，但菌絲融合存在不同的形式，因此，根據(jù)不同的融合形態(tài)將菌絲融合分為3種類型：A-不融合，B-完全融合，C-不完全融合（圖4）。其中完全融合也分為3種情況，頂端對(duì)頂端的融合、頂端對(duì)側(cè)枝的融合、側(cè)枝對(duì)側(cè)枝的融合。

2.2.2菌絲融合群的鑒定 對(duì)所收集的黑龍江省雙城（SC）、大慶（DQ）、克山（KS）、克東（KD）、黑河（HH）、呼蘭（HL）、綏化（sH）共7個(gè)地區(qū)的病菌菌株進(jìn)行菌絲融合群鑒定，根據(jù)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株可將供試菌株分為7個(gè)群，其中，AG-1-IA群有8個(gè)菌株，AG-1-IC群有13個(gè)菌株，AG-3群有10個(gè)菌株，AG-4群有20個(gè)菌株，AG-5群有17個(gè)菌株，AG-6群有10個(gè)菌株，AG-8群有14個(gè)菌株（表4）。說明馬鈴薯立枯絲核菌菌絲融合群在黑龍江省的分布是較廣泛的。由以上數(shù)據(jù)可知，AG-4的分離頻率最大，其次是AG-5，AG-8，AG-I-IC，AG-3，AG-6和AG-I-IA。

2.2.3馬鈴薯黑痣病菌融合群分布頻率 對(duì)收集的100個(gè)菌株經(jīng)過融合群分析鑒定之后，將黑龍江省的菌株分為7個(gè)群，分別是AG-4、AG-5、AG-6、AG-8、AG-1-IC、AG-3和AG-1-IA。其中，AG-I-IA在克山縣、綏化市、大慶市和呼蘭區(qū)均有分布，AG-I-IC在大慶市、克山縣、克東縣和雙城區(qū)均有分布，AG-3在雙城區(qū)、克山縣和綏化市有分布，AG-4在綏化、大慶市、克山縣、雙城區(qū)均有分布，AG-5在雙城區(qū)、綏化市、大慶市、呼蘭區(qū)、克山縣和黑河均有分布，AG-6在雙城區(qū)、大慶市、綏化市和呼蘭區(qū)均有分布，AG-8在克東縣、綏化市、克山縣、大慶市均有分布。其中AG-4出現(xiàn)頻率最高，為20%，是優(yōu)勢(shì)菌群（表5）。

3討論與結(jié)論

馬鈴薯黑痣病在我國(guó)最早是1922年在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)的，到目前為止，它的發(fā)生已經(jīng)非常普遍。病菌侵染幼芽，導(dǎo)致幼芽出土前腐爛甚至死亡形成芽腐，造成缺苗；侵染植株莖基產(chǎn)生凹陷褐色病斑，嚴(yán)重的導(dǎo)致立枯、葉片卷曲及頂端萎蔫的癥狀；侵染薯塊導(dǎo)致其表面產(chǎn)生大小、形狀不規(guī)則的黑色菌核。本研究結(jié)果表明，馬鈴薯黑痣病菌菌絲適宜生長(zhǎng)條件為25～30℃，低溫情況下生長(zhǎng)速度緩慢且在5℃以下不生長(zhǎng)；而甘肅省馬鈴薯種植區(qū)采集的黑痣病菌菌株菌絲生長(zhǎng)溫度最低為4℃，最適為23℃，34℃時(shí)停止生長(zhǎng)。筆者分離菌株的菌絲最適生長(zhǎng)pH為7；而內(nèi)蒙古馬鈴薯種植區(qū)的馬鈴薯黑痣病菌菌絲最高生長(zhǎng)pH為11，在pH為12時(shí)則停止生長(zhǎng)，并且黑暗環(huán)境更適合病菌生長(zhǎng)。筆者比較了幾種不同碳源和氮源對(duì)馬鈴薯黑痣病菌菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，在幾種碳源中，最利于病菌生長(zhǎng)的是可溶性淀粉，而在參與試驗(yàn)的幾種氮源中，最有利于病菌生長(zhǎng)的是酵母粉，這為以后黑痣病菌的室內(nèi)培養(yǎng)和研究提供了參考資料。對(duì)比國(guó)內(nèi)其他研究結(jié)果和本研究結(jié)果可知，馬鈴薯黑痣病菌隨地域的不同而具有不同生長(zhǎng)特性，并且適應(yīng)特定的生長(zhǎng)環(huán)境，其原因可能是病原菌屬于不同群屬，且在當(dāng)?shù)靥囟ōh(huán)境中不斷進(jìn)化適應(yīng)。試驗(yàn)得出的黑龍江馬鈴薯黑痣病菌適宜生長(zhǎng)條件為黑龍江省馬鈴薯黑痣病的防治提供了理論依據(jù)，在實(shí)際應(yīng)用中，在病菌適宜生長(zhǎng)條件出現(xiàn)時(shí)能夠及時(shí)地進(jìn)行預(yù)防。

有關(guān)立枯絲核菌分類，前人已經(jīng)有相關(guān)研究，目前被廣泛認(rèn)可的分類方法是以菌絲融合的方式來確定融合群。利用菌絲融合群的方法，前人進(jìn)行了親緣關(guān)系的研究。這些研究結(jié)果表明，融合群之間的差異明顯大于融合群內(nèi)獨(dú)立菌株的差異。因此，菌絲融合群的分類能夠鑒別出不同類型的種群。立枯絲核菌主要來源于水稻、小麥和棉花等，能夠引起多種植物發(fā)生病害，且其融合群較為多樣。例如AG-4是新疆和四川棉花上的主要融合群；AG-1-IA是四川、江蘇和廣西等地水稻和玉米上的優(yōu)勢(shì)融合群；AG-1和AG-2是上海、浙江、山東、河南以及陜西草坪上檢測(cè)到的立枯絲核菌融合群；AG-5是湖北小麥上立枯病絲核菌主要融合群。本試驗(yàn)將黑龍江省馬鈴薯黑痣病融合群主要分為AG-8、AG-6、AG-5、AG-4、AG-I-IC、AG-3和AG-1-IA，其中AG-1-IA群有8個(gè)菌株，AG-1-IC群有13個(gè)菌株，AG-3群有10個(gè)菌株，AG-4群有20個(gè)菌株，AG-5群有17個(gè)菌株，AG-6群有10個(gè)菌株，AG-8群有14個(gè)菌株。另外有8個(gè)菌株沒有檢測(cè)到融合群，這8個(gè)菌株與所選標(biāo)準(zhǔn)菌株均不融合，其原因可能是本試驗(yàn)所選用的標(biāo)準(zhǔn)菌株只有7株，并不能排除黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌可能存在其他融合群，還有待于進(jìn)一步研究。筆者還對(duì)黑龍江省馬鈴薯黑痣病菌菌絲融合群的分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，其分布非常廣泛，在分布上存在地域差異性。并且有別于中國(guó)北方馬鈴薯黑痣病菌融合群鑒定及遺傳多樣性分析試驗(yàn)中AG-3是優(yōu)勢(shì)菌群、AG-4是次優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)果，本研究結(jié)果表明，AG-4為主要融合群，AG-3所占比例很少，此差異可能是所選取的菌株分離地域差異和試驗(yàn)材料的生態(tài)類型差異所引起。對(duì)不同地域優(yōu)勢(shì)菌群的研究有利于對(duì)病原菌進(jìn)行針對(duì)性防治，為緩解該病原菌引起的病害和減少病原菌引起的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失提供寶貴的理論支持。endprint