葫蘆科植物離體雌核發育研究進展

鄒甜　孫波　王志偉　龔思　陳澤南　孫小武

摘要：離體雌核發育誘導單倍體是植物單倍體育種的重要手段之一，筆者對葫蘆科植物離體雌核發育影響因素的最新研究進展進行了綜述，主要包括基因型、取樣時期和取樣部位、培養基、預處理、栽培季節等對葫蘆科蔬菜離體雌核發育的影響，并對離體雌核發育存在的問題進行了分析和討論，以期為葫蘆科蔬菜離體雌核發育研究工作的開展提供參考。

關鍵詞：葫蘆科；離體雌核發育；單倍體育種；未受精胚珠；未授粉子房

離體雌核發育誘導單倍體是指在離體條件下未受精胚囊細胞經過誘導產生單倍體植株的過程，有未授粉子房培養和未受精胚珠培養2種途徑，是單倍體育種的重要手段之一。1979年San Noeumm首次通過大麥未受精子房培養獲得了單倍體植株，并第一次提出以“雌核發育”來定義這一過程。通過離體雌核發育可以迅速得到單倍體及雙單倍體植株，與常規育種相比，離體雌核發育誘導單倍體技術大大加快了育種進程，提高了育種效率，豐富了種質資源。目前，利用此技術已經成功地從多種植物中獲得了單倍體植株，被廣泛應用于育種實踐和遺傳研究。葫蘆科離體雌核發育研究工作從20世紀90年代開始進行，并成功在西葫蘆、甜瓜、黃瓜上獲得了單倍體或雙單倍體植株。近幾年來，離體雌核發育在葫蘆科蔬菜上更是發展迅速，閔子揚等于2016年首次在南瓜上獲得單倍體植株，而離體雌核發育技術進一步成為黃瓜單倍體育種最常用的育種手段，已陸續育成新品種‘津美3號、‘津優401和‘津優409。另外，離體雌核發育還被應用于分子遺傳圖譜的構建和轉基因育種研究。眾多研究表明，離體雌核發育研究工作的開展對葫蘆科蔬菜育種和遺傳研究具有重大意義，但是此項研究還處于初級階段，還存在出胚率低、胚質量差等諸多問題。基于此，筆者對影響葫蘆科蔬菜離體雌核發育誘導的影響因素進行分析和總結，以期為葫蘆科蔬菜離體雌核發育研究工作的開展提供參考。

1影響離體雌核發育的主要因素

1.1基因型

大量研究表明離體雌核發育和離體雄核發育一樣具有明顯的基因依賴性，供體植株的基因型不僅影響出胚率，還影響胚的質量。在同等誘導條件下，不同基因型材料其誘導率和出胚率有極顯著差異，特定的基因型只對特定的培養基有反應。榮文娟等以8個不同基因型西瓜品種為材料進行未受精胚珠培養，其胚珠啟動率差異較大，從57.2%到92.3%不等。劉立功等進行黃瓜離體雌核發育研究，發現7個品種都能誘導出胚狀體，但其出胚率最高可達25.3%，最低只有0.7%。閔子揚等對6個南瓜品種進行了未受精子房離體培養，其中5個品種可以誘導出胚狀體，但出胚率有較大差異，另外1個品種不能誘導出胚。

1.2取樣時期和取樣部位

取樣時期關系到胚珠中胚囊細胞的發育程度，而胚囊發育時期對離體雌核發育胚狀體的誘導有著極其重要的影響。不同種類作物適合進行離體雌核發育誘導的取樣時期不盡相同，在葫蘆科作物中以接近成熟或成熟的胚囊細胞效果最好。謝冰等認為開花當天的西葫蘆未受精胚珠的活力較高最有利于離體雌核發育。孫守如等、陳玲、閔子揚等均認為開花當天南瓜雌花進行離體雌核誘導其出胚率最高，且孫守如等認為開花當天的外植體誘導形成愈傷組織少且不易褐化。另外，Li等以甜瓜為研究材料得到了相同結果。Gemes-Juhfisz等研究黃瓜離體雌核發育則發現雌花開放前6h的胚囊剛好成熟，此時胚的誘導率最高，而杜勝利、Diao等則認為開花前2～3d的黃瓜未受精子房的胚誘導率最高。

此外，子房的發育情況也影響雌核發育的誘導。趙曉菲和劉立功等研究了取樣部位對離體雌核發育的影響，結果表明，采收于相對中間的節位的未受精子房有利于誘導雌核發育，子房采收部位過高或過低都不利于胚狀體誘導。在黃瓜未授粉子房培養研究中發現，取自第21～第30節位的子房誘導時出胚率最高，節位往上出胚率降低。

1.3培養基

1.3.1基本培養 基基本培養基對離體雌核發育胚狀體誘導率有一定的影響，從研究報道來看，葫蘆科作物大部分使用MS作為基本培養基進行離體雌核發育誘導。謝冰以西葫蘆為試材研究了MS、N6、B5、Miller 4種培養基對離體雌核發育的影響，發現MS和N6培養基的誘導效果較好。程慧等同樣以西葫蘆未受精子房為材料比較MS、B5、N6和White 4種培養基并得到了相同的結果，其研究表明MS基本培養基更有利于誘導胚狀體，胚狀體誘導率達16.67%，N6培養基次之，胚狀體誘導率為13.33%。在黃瓜未受精子房培養中也有使用CBM培養基和改良培養基。

1.3.2外源激素 前人研究表明，培養基中外源激素的種類和濃度配比對雌核發育的誘導有著極其重要的影響，但是不同作物甚至不同品種所適用的激素種類和濃度不同。在葫蘆科離體雌核發育研究中2，4-D、NAA、6-BA、TDZ等被廣泛應用。以西葫蘆為試材，趙曉菲研究發現MS+0.1mg·L^-1NAA+2.0mg·L^-16-BA培養基能有效誘導不定芽，而葛志東的試驗中以3.0mg·L^-12，4-D+0.25mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA效果最好。以南瓜為試材，孫守如等認為最佳誘導培養基為MS+1.0mg·L^-12，4-D+0.25mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-16-BA，其出胚率高達31.1%，而閔子揚等則認為添加0.06mg·L^-1TDZ時誘導可直接出胚，操作上更簡潔方便。以黃瓜為試材，裴曉利、LI等、E.Moqbeli等研究了TDZ對離體雌核發育的影響，并一致認為TDZ有利于胚狀體的誘導。裴曉利的試驗結果表明，培養基中添加0.06mg·L^-1或0.08mg·L^-1TDZ有利于黃瓜胚狀體誘導，誘導率高達92.00%和93.10%。E.Moqbeli等則認為添加0.04mg·L^-1TDZ效果較好。LI等認為添加0.03～0.07mg·L^-1的TDZ均有利于黃瓜離體雌核發育誘導，但是不同品種的最適TDZ濃度不一樣。另外，TDZ也有利于甜瓜和西瓜離體雌核發育。榮文娟等曾報道TDZ較2，4-D和KT更有利于促進西瓜雌核發育，在培養基中添加0.05mg·L^-1TDZ+2.0mg·L^-16-BA+3mg·L^-1NAA時愈傷誘導率最高。另外，TDZ和NAA結合使用有利于胚狀體誘導和生根成苗，以0.05mg·L^-1TDZ+0.25mg·L^-1NAA效果最好。endprint

除此之外，IAA、IBA和NAA等激素多被用于再生植株的生根培養，KoLI等在進行甜瓜未受精胚珠培養時對IAA、IBA、NAA3種激素對再生植株生根的影響進行了比較，發現在相同濃度下IAA比IBA和NAA更有利于再生植株生根。近年來，GA也被用于離體雌核發育研究，有報道在再生培養基中添加0.4-0.8mg·L^-1的GA時可有效打破再生植株“花打頂”現象從而提高植株再生率，且GA有利于再生植株生根，使根系粗且長。

1.3.3蔗糖 陳學軍等認為碳源影響著培養基的滲透壓，而雌核發育需要在較低的滲透壓中進行。在前人研究中，葫蘆科離體雌核發育的培養基中多添加30g·L^-1蔗糖。謝冰等、Shalaby等都曾研究蔗糖濃度對雌核發育誘導的影響，謝冰等人的研究表明，在MS培養基中分別添加10、20、30、40g·L^-1蔗糖時，添加30g·L^-1蔗糖的培養基出胚最多，Shalaby等人則是在培養基中分別添加了30、60、90g·L^-1蔗糖，發現添加30g·L^-1蔗糖時胚珠啟動率最高，90g·L^-1時胚珠幾乎不發育。另外，蔗糖濃度對胚狀體成苗有一定影響，在培養基中添加20g·L^-1蔗糖時胚狀體成苗率最高，西葫蘆再生植株生長健壯，較易馴化、移栽。

1.3.4附加成分 通常培養基中也會添加少量附加成分，如抗壞血酸（Vc）、活性炭（AC）、硝酸銀（AgNO₃）、各種氨基酸等等。Vc、AC、和AgNO₃都是常見的抗氧化劑和吸附劑，可以有效減輕外植體的褐化，有利于離體雌核發育誘導和植株的再生。另外，陳學軍等認為高濃度的NO_3-有利于不定芽的產生，刁衛平等、裴曉利、LI等的試驗均證明硝酸銀有利于黃瓜離體雌核發育。并且，刁衛平等人認為，硝酸銀可以提高胚發生率，同時能縮短胚出現的時間并提高胚的產量，最佳添加量為20mg·L^-1。

1.4預處理

預處理方式對離體雌核發育誘導有著極其重要的影響。預處理主要有黑暗熱激和低溫處理2種途徑。一般認為預處理改變了細胞的生理狀態，影響其分裂方式和分化方向，但是不同基因型對溫度的敏感度不同，因此最佳處理溫度和時間也不一樣。多項研究表明適當的熱激處理可以激發雌核發育的啟動，縮短胚狀體的誘導時間。35℃熱激在試驗中應用較多，G6mes-Juhtlsz等、E.Moqbeli等、Pivada等的研究均表明，熱激有利于黃瓜離體雌核發育，并認為在35℃條件下熱激2～4d時誘導率和植株再生率最高，孫守如等、陳玲㈣、葛志東則認為熱激處理5d效果最好。然而，王璐等認為25℃比35℃更適合黃瓜離體雌核發育的啟動，這可能與供體材料基因型不同有關，牛明明也認為30℃較35℃更有利于甜瓜雌核發育誘導。

低溫預處理的誘導效果隨外植體不同而不同，Metwally等認為4℃低溫預培養不利于南瓜離體雌核誘導，但是有利于甜瓜離體雌核誘導。Malik等也認為低溫預處理（4℃）4d可以有效提高甜瓜出胚率。而榮文娟等㈣的試驗結果表明在進行西瓜雌核誘導時4℃處理沒有明顯效果，且其對胚珠反應率和愈傷誘導率的影響隨培養基成分不同而變化。

1.5栽培季節

栽培季節影響著離體雌核發育的誘導率和出胚率。陳學軍等、趙曉菲曾報道不同播期的西葫蘆雌核發育誘導率存在極顯著差異，以秋播的誘導率最高，夏季次之，春季栽培誘導率最低。陳學軍等人認為，這可能與日照長度有關，西葫蘆是短日照植物，秋播時短日照條件刺激了雌核發育相關基因的表達。魏愛民等的研究也表明，溫度較高且陽光充足時黃瓜未受精子房的出胚率和成苗率明顯高于其他季節，并且塑料大棚內的供體植株比露地植株污染率低且更容易誘導單倍體。

1.6接種方式

子房或胚珠不同的消毒方式和切割方式對胚狀體的誘導也有一定影響。陳玲、閔子揚等有報道，先切片再消毒比先消毒再切片更有利于南瓜未受精子房進行離體雌核誘導。陳學軍等和陳玲比較了橫切、縱切、切啄、完整胚珠4種方式對胚狀體誘導率的影響，均認為橫切最有利于離體雌核發育的誘導，愈傷誘導率最高達28%。

2再生植株的馴化移栽

再生植株的苗齡、質量、馴化方式、移栽時的溫度和基質對再生植株的成活率都有不同程度的影響。謝冰等在研究的基礎上提出了“循序漸進”原則，讓組培苗逐漸適應出瓶后的環境，即在西葫蘆再生植株長至7～8片葉時置于晝溫22～28℃、夜溫12～18℃條件下，進行先閉瓶再開瓶逐步馴化，當移栽基質為V_蛭石：V_草炭為1：1時成活率最高，可達95.0%以上。趙曉菲等在再生植株具有5～6片真葉時馴化移栽，成活率也高達90.0%。

3再生植株倍性鑒定

離體雌核培養的再生植株理論上起源于胚囊成員細胞，所以再生植株應該是單倍體和自然加倍的雙單倍體，但也有可能是由珠心、珠被等體細胞發育而成的二倍體，因此再生植株倍性的鑒定是后續利用的基礎。植株鑒定的方法早有報道，主要有染色體計數法、流式細胞測定法、葉片保衛細胞葉綠體計數法、雜交鑒定法、同工酶鑒定法和形態學鑒定法等。杜勝利曾以黃瓜離體雌核培養的再生植株為材料研究和比較了幾種不同的倍性鑒定方法，發現最有效最直接的鑒定方法是體細胞染色體計數法，試驗結果更為準確可靠。不同倍性植株的葉片保衛細胞葉綠體個數、染色體中心直徑和異染色體數目都不一樣，可以間接鑒定黃瓜再生植株的倍性。另外，也可以根據不同倍性植株的長勢、花冠形態、花粉粒及結籽的差異來輔助判斷再生植株倍性。目前倍性鑒定應用最多的是染色體計數法和流式細胞儀檢測，但是二倍體再生植株就必須應用分子標記等技術鑒定其純合性。不過我們也可以對再生植株自交后代進行整齊度試驗，這樣不僅可以確定再生植株純合性，同時還可以調查記錄其農藝性狀。

4問題與展望

利用離體雌核發育技術進行單倍體育種已經成功地在黃瓜上進行了實踐，天津科潤黃瓜研究所將離體雌核發育技術與常規育種結合，成功培育出了新一代長勢強、分支少、抗病性強、豐產性好的黃瓜品種，其利用單倍體技術創制黃瓜育種新材料研究達到了國際先進水平。與離體雄核發育相比離體雌核發育具有許多優勢，通過離體雌核發育產生的再生植株白化苗比例低，并且能夠從雄性不育植株或雌株中培育出單倍體植株。但是現今階段離體雌核發育誘導單倍體技術還存在許多問題，如出胚率低、重復性差、再生植株玻璃化嚴重、畸形率高、倍性鑒定難度高等。離體雌核發育基因依賴性很強，有些品種的出胚率很低，甚至無法誘導出胚。另外，離體雌核發育誘導過程受其他如植株生長環境、胚囊發育時期、激素水平等多種因素的影響，因此其重復性不高，很難進行規模化育種材料創制。此外，再生植株培養過程中玻璃化嚴重和畸形率高造成再生植株成活率低，是離體雌核發育應用于育種實踐的又一大障礙。為提高試管苗成活率，胡芳芳等對誘導培養基進行了篩選，并優化了植株培養條件，降低了玻璃化程度，但是最高成活率也僅有46.67%。

雖然葫蘆科植物離體雌核發育技術已經取得一些進展，但單倍體誘導率和植株成活率仍然很低，仍然無法滿足育種實踐的需要，所以如何建立高效、穩定的植株再生體系是我們亟待解決的問題。另外，深入研究離體雌核發育機制也是提高單倍體育種技術效率的關鍵。通過離體雌核發育技術創制大量育種新材料，然后利用分子標記輔助選擇可進一步提高育種效率。所以，打破基因型依賴，建立高效、可重復的培養體系，探索更為簡單、有效的倍性鑒定方法，與常規育種和分子標記輔助育種緊密結合，對雌核發育進行深層次研究是我們科研工作者的努力方向。endprint