索拉非尼對不同人肝癌細胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達的影響

徐 瀚， 周 石， 王黎洲， 安天志， 蔣天鵬， 宋 杰， 李 興

原發性肝癌是世界上最常見癌癥之一，死亡率位居癌癥死亡第2［1］。據2000年癌癥發病率報告，原發性肝癌在女性最常見惡性腫瘤中排名第8，在男性中名列第5［2］。因此，亟需盡快尋找一種針對肝癌的新治療方法及新治療靶點。目前對肝癌的治療策略包括傳統外科切除術［3］、細胞生物治療［4-5］、介入治療［6-7］、局部放療［8］、傳統化療［9］、中藥治療［10］及分子靶向藥物治療等。索拉非尼是目前唯一被我國及歐美多個國家批準應用于中晚期肝癌治療的分子靶向藥物，其通過抑制血管內皮生長因子（VEGF）水平，達到抑制肝癌組織新生血管及微血管生成目的［11］。 B7 蛋白家族包括 B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4，它們是一組與T細胞和B細胞活化及免疫功能有關的共刺激分子，被廣泛應用于自身免疫疾病和癌癥治療［12-13］。本研究旨在以免疫印跡法（western blot，WB）觀察不同人肝癌細胞株（HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、 QGY-7703、 SMMC-7721、 MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6）和正常人肝細胞株（HL-7702）蛋白表達，在其中篩選出B7-H3和B7-H4蛋白高表達細胞株并應用索拉非尼，WB和溴化噻唑藍四氮唑（MTT）比色法檢測B7-H3和B7-H4蛋白表達，了解索拉非尼對不同人肝癌細胞株的抑制作用及B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細胞株中過表達是否常見，從而為肝癌預防和治療提供一候選新靶標。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

細胞培養采用10%胎牛血清RPMI-1640培養基 （HyClone，Logan，Utah，USA）和 DMEM 培 養 基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；抗 β-肌動蛋白、B7-H3蛋白、B7-H4蛋白（一抗）及辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗（Sigma-Aldrich，Taufkirchen， Germany）；索 拉 非 尼 原 粉 藥 劑 （LKT Laboratories，St Paul，Minnesota，USA）；增強型二辛可酸（BCA）蛋白測定試劑盒（Beyotime，Haimen，China）。

1.2 細胞培養

人肝癌細胞株包括 HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、 QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6（美國菌種保藏中心 ATCC，Manassas，VA，USA）； 正常人肝細胞株為 HL-7702（ATCC， Manassas，VA，USA）。所有細胞均在37℃、5%二氧化碳和95%空氣環境中置于含10%胎牛血清并加入100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640或DMEM培養基中培養。

1.3 索拉非尼抑制人肝癌細胞株測定

采用MTT比色法評價索拉非尼對Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 肝 癌 細胞株的抗增殖活性作用。將不同人肝癌細胞株接種于96孔培養板中，培養24 h后分別給細胞加入0（對照）、1.25、2.5、5、10、15、20、40 μmol/L 劑量索拉非尼，48 h后混合MTT并再培養3 h，最后用微板讀數器（Perkin-Elmer，USA）在 570 nm 處檢測光密度（OD）。以公式抑制率（%）＝（OD對照－OD處理）/OD對照×100%［14］計算索拉非尼對不同人肝癌細胞株抑制率。

1.4 WB檢測

對 HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6、HL-7702 細胞株，分別以 0（對照）、5、10、20 μmol/L 劑量索拉非尼進行處理，48 h后用增強型BCA蛋白測定試劑盒分別提取并測定以上細胞株中總蛋白濃度；采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS/PAGE）分離每個細胞株約30μg總蛋白，然后移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，化學發光法檢測抗β-肌動蛋白、B7-H3、B7-H4蛋白等一抗，隨后偶聯山羊抗兔/HRP孵育，抗β-肌動蛋白抗體檢測蛋白質負荷。

1.5 數據分析

采用SPSS 19.0軟件（IBM，USA）進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，數據經單因素方差分析后再以事后分析（Dunnet t檢驗）進一步比較不同組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人肝癌細胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達

WB法檢測顯示，所有人肝癌細胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達與正常人肝細胞株（HL-7702）相比，均顯著上調（P＜0.01），見圖 1。

2.2 索拉非尼對人肝癌細胞株的抑制作用

在B7-H3和B7-H4蛋白高表達的所有肝癌細胞株中選擇最為明顯的 Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6等5種肝癌細胞株，探討索拉非尼對其表達的影響。在此實驗之前，先用MTT比色法測定索拉非尼對這些人肝癌細胞株的細胞毒性，以確定索拉非尼對這些肝癌細胞株有抑制作用，結果發現索拉非尼對上述5種肝癌細胞株均具有抑制作用，它們的半抑制濃度（IC50）值分別為14.56、9.14、9.46、17.21、9.29 μmol/L，見圖 2。

圖1 B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細胞株中表達

圖2 索拉非尼對不同人肝癌細胞株抑制率

2.3 索拉非尼對B7-H3和B7-H4蛋白表達的影響

分別以5、10、20μmol/L劑量索拉非尼處理不同人肝癌細胞株（Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6）48 h后WB檢測顯示，不同人肝癌細胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達均較對照組明顯下調（P＜0.01），見圖 3、4。

圖3 索拉非尼對MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6中B7-H3蛋白表達影響

圖4 索拉非尼對Hep3B、BEL-7404、MHCC97H中B7-H4蛋白表達影響

3 討論

免疫應答缺陷可能有助于腫瘤細胞生長，T細胞在免疫應答中通常起著較為重要的作用，其中共刺激配體CD80和CD86對機體啟動和維持免疫反應密切相關，它們在腫瘤細胞中表達缺失被認為是腫瘤免疫逃逸的主要原因之一［15］。誘導抑制性因子如細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4，CD152）和程序性細胞死亡分子-1（PD-1，CD279）在免疫細胞及腫瘤細胞中表達并與抑制性因子配體結合，往往能夠參與腫瘤發?。?6］。如今阻斷抑制性輔助因子間相互作用已成功地應用于腫瘤治療［17］，阻斷免疫細胞中抑制性輔助因子及腫瘤細胞中抑制性輔助因子配體表達，可能是防止腫瘤細胞免疫逃逸的重要方法。

B7-H4和B7-H3是B7蛋白家族中抑制性輔助因子配體，與活化T細胞免疫功能有關［18-19］。Northern印跡法測定發現B7-H4蛋白在胸腺、肺、脾臟轉錄水平表達［20］，B7-H3蛋白廣泛在淋巴器官、肝臟、睪丸、子宮、肺、骨骼肌等轉錄水平表達［21］。 B7-H4和B7-H3蛋白似乎只在細胞翻譯水平受限［22］。有報道發現B7-H4和B7-H3蛋白在非小細胞肺癌中有表達［23］，也有研究報道B7-H4蛋白在人肝癌細胞株 BEL-7404 轉錄水平表達［24］。

索拉非尼是一種多激酶抑制劑，目前已廣泛應用于肝癌治療［25］，其一方面能通過阻斷RAF/MEK/RAK等信號通路抑制腫瘤細胞增殖，另一方面通過抑制血小板衍生生長因子（PDGF）受體及VEGF因子抑制腫瘤血管生成，具雙重抗腫瘤作用。早在2008年，歐美國家便完成了索拉非尼SHARPⅢ期臨床試驗，結果顯示索拉非尼可使晚期肝癌患者中位生存期延長44%、中位疾病進展時間（TTP）延長74%、死亡風險降低31%［26］。以中國為主的亞太地區2009年完成OrientalⅢ期臨床試驗，也顯示出與歐美國家相近的結果［27］。

然而，目前尙不清楚不同人肝癌細胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達情況及索拉非尼對不同人肝癌細胞株的細胞毒作用。本研究結果顯示，B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細胞株（HepG2、Hep3B、BEL-7402、 BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6）中表達，與正常人肝細胞株HL-7702相比，均明顯上調（P＜0.01）；WB法和MTT比色法檢測顯示索拉非尼通過抑制B7-H3和B7-H4蛋白表達對 Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6等人肝癌細胞株產生細胞毒性，進而抑制肝癌細胞株生長；索拉非尼對Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 肝癌細胞株均有細胞毒活性，其 IC50值分別為 14.56、9.14、9.46、17.21、9.29μmol/L；與對照組相比，在分別加入 5、10、20μmol/L等不同劑量索拉非尼48 h后，Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 等人肝癌細胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達均發生顯著下降（P＜0.01）。B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細胞株中過表達常見，因此認為其可能影響腫瘤免疫逃逸，而降低B7-H3和B7-H4蛋白在肝癌組織中表達則可能是預防和治療肝癌的候選靶點之一。本研究發現B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細胞株中均過表達，但其與不同類型肝癌之間的關系尚需更深入研究，以達到個性化治療目的。

本研究結論認為，B7-H3蛋白和B7-H4蛋白在不同人肝癌細胞株中通常過表達，可對腫瘤免疫逃逸機制造成影響，可能為肝癌預防和治療提供一個新靶點。

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