磷脂酶Cβ1上調(diào)表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌增殖和預(yù)后相關(guān)

褚 亞， 周 石， 王黎洲， 安天志， 蔣天鵬， 宋 杰， 李 興

肝細(xì)胞肝癌（HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)［1-3］。近期研究發(fā)現(xiàn)癌基因與癌基因激活途徑對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展有重要作用［4］。 磷脂酶 Cβ1（PLCβ1）由位于染色體20p12的PLCβ1基因編碼而成，作為最初G蛋白偶聯(lián)受體與PLCβ異構(gòu)體偶聯(lián)，催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）形成 1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）、二酰甘油（DAG）［5］并在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，該通路調(diào)節(jié)異常往往加快腫瘤發(fā)展［6］。Gα蛋白激活PLCβ1導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，最終引起細(xì)胞異常增殖［7］。PLCβ1參與多種疾病發(fā)展過(guò)程，精神分裂癥患者大腦中能檢測(cè)其異常表達(dá)［8］。小鼠PLCβ1基因剔除后表現(xiàn)出與精神分裂癥相關(guān)認(rèn)知行為［9］。作為成肌細(xì)胞分化關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，PLCβ1對(duì)強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良的骨骼肌分化有促進(jìn)作用［10］。PLCβ1能減少細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和防止α-突觸核蛋白聚集［11］，表明擴(kuò)增其基因能促進(jìn)K562細(xì)胞生長(zhǎng)和防止細(xì)胞凋亡［12-13］。 此外，PLCβ1陽(yáng)性靶向細(xì)胞周期蛋白 D3并通過(guò)蛋白激酶Cα介導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖［14］。 PLCβ1過(guò)表達(dá)使 Swiss 3T3細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期 S 期［15］。致癌過(guò)程中 PLCβ1 水平也有所提高［16］。Molinari等［17］證實(shí)乳腺癌中 PLCβ1基因拷貝數(shù)發(fā)生改變，乳腺癌組織學(xué)分級(jí)和增殖指數(shù)與PLCβ1過(guò)表達(dá)有關(guān)。為了解PLCβ1對(duì)HCC細(xì)胞增殖及預(yù)后的影響，本研究探討PLCβ1表達(dá)能否促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，刪除或抑制PLCβ1能否延緩其增殖，從而為預(yù)防和治療HCC提供新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T細(xì)胞，LO2人肝細(xì)胞株，人肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、LM3、Huh7、H7402（美國(guó)菌種保藏中心ATCC），均置入含10%胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM，美國(guó)Gibco公司），并置于含5%CO2、37℃95%空氣加濕孵化器中培養(yǎng)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，肝癌標(biāo)本由醫(yī)院病理科提供，均經(jīng)病理證實(shí)為HCC。采用組織芯片（tissuemicroarrays，TMA）技術(shù)，分別將芯片載入 51 例（TMA1）、90 例（TMA2）HCC 患者腫瘤及癌旁組織（上海芯超生物科技公司），二甲苯脫蠟與乙醇脫水復(fù)水，于檸檬酸和內(nèi)源性過(guò)氧化物酶緩沖液中作抗原回收，再用10%山羊血清清洗，減少TMA非特異性染色；4℃下孵育抗 PLCβ1抗體（1∶200，sc-205，美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司）；磷酸緩沖液（PBS）洗滌后，用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗30min，再次PBS洗滌；用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精-伊紅（HE）復(fù)染。采用半定量評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)染色片強(qiáng)度（0、1、2、3）和陽(yáng)性百分比，兩分?jǐn)?shù)相乘計(jì)算最終得分，分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

采用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）分離細(xì)胞總RNA，PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑盒（日本 TaKaRa公司）合成 cDNA第 1鏈，SYBR Green染色7500序列（美國(guó)ABI公司）檢測(cè)PLCβ1 mRNA表達(dá)水平，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)部對(duì)照。人PLCβ1基因擴(kuò)增引物：正向引物為5’-GATGAGCCCAGATGGCCG-3’， 反向引物為 5’-AGTTGAGTCATCATCCCACTTGA-3’。 β-肌動(dòng)蛋白引物：正向引物為5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’， 反向引物為 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.4 蛋白印跡檢測(cè)

采用抗磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2（4376#）、抗 ERK1/2（9102#）（美國(guó) CST 公司）、抗-雙特異性磷酸酶（DUSP）1（sc-370）、抗 β-肌動(dòng)蛋白（sc-47778）（美國(guó) Santa Cruz生物技術(shù)公司）檢測(cè)PLCβ1印跡。將細(xì)胞置于含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）緩沖液（美國(guó)Sigma公司）裂解，二辛可酸（BCA）法測(cè)定總蛋白濃度，將60μg總蛋白于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）下分離，分離蛋白移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore公司）并用無(wú)脂牛奶封膜，一抗孵育過(guò)夜；Tris緩沖0.9%NaCl液（TBST）洗滌后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗一起孵育，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色。

1.5 PLCβ1過(guò)表達(dá)構(gòu)建與RNAi介導(dǎo)PLCβ1敲除

慢病毒載體pLK0.1-TRC克隆PLCβ1 cDNA。psPAX2和pMD2G質(zhì)粒構(gòu)建重組慢病毒細(xì)胞系，以便穩(wěn)定地過(guò)表達(dá)PLCβ1；shRNA有限擾碼序列編碼PLCβ1作為對(duì)照組。

1.6 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7活性檢測(cè)

將細(xì)胞接種至96孔板（2×103細(xì)胞/孔）。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8，日本Dojindo公司）分別于24、48、72、96 h 評(píng)估細(xì)胞活力，450 nm 處測(cè)定其吸光度。72 h時(shí)清除血清，檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3/7活性。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7 集落形成檢測(cè)

將細(xì)胞接種至 6孔板（2×104細(xì)胞/孔）并培養(yǎng)10 d，指定時(shí)間點(diǎn)用PBS洗滌細(xì)胞2次，結(jié)晶紫處理10min后洗滌，然后計(jì)數(shù)、檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.8 腫瘤治療

141例HCC患者均接受外科手術(shù)切除，術(shù)后常規(guī)每 1、3、6、12 個(gè)月門(mén)診隨訪甲胎蛋白（AFP），腹部增強(qiáng)CT和/或MRI；12個(gè)月后每半年隨訪1次。若患者影像學(xué)表現(xiàn)提示腫瘤復(fù)發(fā)和/或AFP增高，則每隔1～3個(gè)月予介入灌注化療栓塞及射頻消融等綜合治療。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)血分析和圖形顯示。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，卡方檢驗(yàn)分析臨床特征與PLCβ1表達(dá)的關(guān)系，t檢驗(yàn)評(píng)估體外研究，Kaplan-Meier法評(píng)估總生存期（OS），單因素和多因素風(fēng)險(xiǎn)比分析用Cox回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLCβ1表達(dá)與HCC預(yù)后關(guān)系

免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)顯示，TMA1、TMA2細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到PLCβ1蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC組織中PLCβ1表達(dá)比癌旁組織明顯增高（圖1）。141例HCC標(biāo)本中80例標(biāo)本檢測(cè)顯示PLCβ1呈高表達(dá)，PLCβ1表達(dá)與巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期密切相關(guān)（P＝0.014 5），與其它參數(shù)和特征無(wú)顯著相關(guān)（表1）；Kaplan-MeierK曲線與OS分析顯示，PLCβ1高表達(dá)患者比低表達(dá)患者生存率低，平均生存時(shí)間明顯縮短（P＝0.001）（圖 2），表明 PLCβ1 表達(dá)與OS顯著相關(guān)；Cox回歸單因素分析顯示OS與腫瘤大小、BCLC分期、PLCβ1表達(dá)有關(guān)，多因素分析表明PLCβ1顯著表達(dá)是與HCC患者OS明顯相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。

2.2 PLCB1對(duì)HCC細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖1 PLCβ1在HCC組織中過(guò)表達(dá)

表1 PLCβ1表達(dá)與HCC患者臨床參數(shù)相關(guān)性 n

圖2 141例HCC患者Kaplan-Meier分析

表2 Cox回歸分析141例HCC患者OS結(jié)果

RT-PCR和蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞系中PLCβ1對(duì)應(yīng)mRNA和蛋白（圖3）水平表達(dá)均比LO2人肝細(xì)胞系高。蛋白印跡檢測(cè)證實(shí)慢病毒載體構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PLCβ1的HepG2和Huh7細(xì)胞（圖4①），CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明PLCβ1過(guò)表達(dá)的HepG2和Huh7細(xì)胞活力比對(duì)照細(xì)胞明顯增高（圖4②），集落形成檢測(cè)和結(jié)晶紫染色顯示PLCβ1過(guò)表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)能力比對(duì)照細(xì)胞增強(qiáng)（圖4③），細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PLCβ1過(guò)表達(dá)細(xì)胞caspase-3/7活性顯著降低（圖4④）；表明PLCβ1過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)PLCβ1細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制其凋亡。慢病毒遞送shRNA（SH-1和SH-2）降低PLCβ1內(nèi)源性表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，Hep3B和LM3細(xì)胞shRNA表達(dá)PLCβ1比SH-1和SH-2增強(qiáng)（圖5①），體外細(xì)胞存活率和集落形成檢測(cè)顯示PLCβ1低表達(dá)的SH-1和SH-2細(xì)胞增殖抑制明顯（圖5②③），SH-1和SH-2細(xì)胞caspase-3/7活性比對(duì)照（shCON）細(xì)胞增高（圖5④）；表明下調(diào)PLCβ1能抑制PLCβ1細(xì)胞惡性表達(dá)。

2.3 PLCβ1致癌性與ERK活化關(guān)系

蛋白印跡檢測(cè)ERK激活狀態(tài)表明，PLCβ1高表達(dá)的HepG2和Huh7細(xì)胞顯著刺激ERK1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化，而降低PLCβ1表達(dá)的Hep3B細(xì)胞有效下調(diào)ERK1/2通路磷酸化水平（圖6①②），集落形成檢測(cè)顯示ERK抑制劑U0126可抑制PLCβ1對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用（圖6③），DUSP1表達(dá)均無(wú)明顯變化；表明PLCβ1可調(diào)節(jié)激活HCC細(xì)胞ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)致癌活性。

3 討論

癌基因激活與關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活通常是非腫瘤細(xì)胞瘤變必不可少的環(huán)節(jié)［18-19］。本研究表明，PLCβ1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，反之抑制生長(zhǎng)；ERK信號(hào)通路異常激活可能與PLCβ1有關(guān)；PLCβ1表達(dá)升高可能與HCC進(jìn)展呈正相關(guān)。因此，PLCβ1可能作為一種新的HCC獨(dú)立預(yù)后因素。

圖3 PLCβ1在LO2人肝細(xì)胞系和人肝癌細(xì)胞系中表達(dá)

圖4 PLCβ1過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2和Huh7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖5 PLCβ1低表達(dá)對(duì)Hep3B和LM3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖6 ERK對(duì)PLCβ1致癌活性的影響

細(xì)胞外信息傳遞可刺激細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活。PLCβ1可編碼磷脂酰肌醇特異酶，激活G蛋白并催化其形成第2信使，啟動(dòng)進(jìn)一步細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［20］。有研究表明PLCβ1在調(diào)節(jié)疾病各種功能方面起重要作用［11-21］。小鼠模型中PLCβ1低表達(dá)可能誘發(fā)癲癇［7］。 Hela 細(xì)胞中 PLCβ1 參與 IP3 生成［22］。 乳腺癌組織學(xué)分級(jí)和增殖指數(shù)與PLCβ1密切相關(guān)，PLCβ1 低表達(dá)患者預(yù)后相對(duì)較好［17］。

既往研究發(fā)現(xiàn)，位于染色體8q和20的某個(gè)基因可作為肝母細(xì)胞瘤預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因素［23］。PLCβ1基因位于染色體20p12，其上調(diào)情況受到關(guān)注。但迄今尚未見(jiàn)PLCβ1表達(dá)與HCC間關(guān)聯(lián)相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明PLCβ1與肝癌BCLC分期有相關(guān)性，與腫瘤大小、是否伴發(fā)肝硬化等無(wú)明顯相關(guān)，但腫瘤發(fā)生涉及復(fù)雜機(jī)制；PLCβ1可能作為一種生物標(biāo)志物，明確HCC表型；PLCβ1高表達(dá)患者表現(xiàn)出較低OS。多因素分析表明PLCβ1表達(dá)是HCC獨(dú)立預(yù)后因素。

PLCβ1促進(jìn)肝癌進(jìn)展機(jī)制尚不明確。本研究體外實(shí)驗(yàn)表明PLCβ1過(guò)表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，并激活已證明能影響細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ERK激活是通過(guò)調(diào)節(jié)DUSP去磷酸化實(shí)現(xiàn)的［24］。PLCβ1改變引起DUSP1表達(dá)變化，提示ERK激活。此外，胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）-Ⅰ可能引起細(xì)胞核ERK活化，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞核PLCβ1磷酸化，啟動(dòng)磷酸肌醇循環(huán)［25］，這可能是PLCβ1與ERK信號(hào)通路之間調(diào)節(jié)環(huán)路。近年抑制ERK激酶活性化合物研究已取得部分前期臨床結(jié)果，在癌癥治療中取得一些進(jìn)展［26］。本研究發(fā)現(xiàn)PLCβ1過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的部分細(xì)胞增殖效應(yīng)，可被ERK抑制劑阻斷。

總之，本研究由肝癌發(fā)生發(fā)展中的臨床標(biāo)本和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，HCC患者PLCβ1過(guò)表達(dá)可能在促進(jìn)腫瘤發(fā)生中起重要作用，且與侵襲性行為密切相關(guān)，可作為HCC預(yù)后的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)；抑制PLCβ1介導(dǎo)的信號(hào)通路可能會(huì)控制HCC進(jìn)展，PLCβ1可能是今后肝癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。

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