連接酶-ELISA檢測K-ras基因突變方法研究*

肖 娜，唐一通△,崔海忠，李智山，鄒玖明

(1.湖北文理學院醫學院，襄陽 441053；2.湖北文理學院醫學院棗陽臨床學院，棗陽 441200；3.湖北文理學院附屬醫院，襄陽 441021)

K-ras基因是常見的致癌基因，其突變會造成表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑類和EGFR抗體類藥物的耐藥，K-ras基因突變檢測能夠幫助腫瘤患者制定個體化治療方案，提高臨床治療的針對性和有效性[1-2]。目前，多種方法可進行K-ras基因突變檢測[3-8]。由于DNA測序靈敏度較低，而高分辨率熔解曲線法[6]、焦磷酸測序[8]等方法雖具有較高的靈敏度，但其對實驗儀器、實驗條件具有很高的要求，在只具備簡單實驗條件的常規臨床檢測中很少能夠應用。基于此，本研究建立了一種簡便、快速、靈敏的K-ras突變檢測方法，并以肺癌血漿標本為檢測對象，對K-ras基因12位密碼子的6個點突變進行了檢測。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 非小細胞肺癌血漿標本72例收集于湖北文理學院附屬醫院和棗陽臨床學院，抽提血漿循環DNA，-20 ℃保存。

1.1.2寡核苷酸檢測探針 檢測探針設計方法見圖1，用4條特異性檢測探針P-12(SRC)-N(N=A/T/G/C)和1條共用探針P-12(SRC)檢測K-ras基因12位密碼子的G12S、G12R、G12C 3種突變。P-12(SRC)-N探針的5′端為通用擴增序列Tag1，中間序列為與模板同源互補序列H1，3′端為與突變位點堿基對應的互補堿基N。P-12(SRC)探針的5′端為與模板同源互補序列H2，3′端為通用擴增序列Tag2。同理，用4條特異性檢測探針P-12(DAV)-N(N=A/T/G/C)和1條共用探針P-12(DAV)檢測K-ras基因12位密碼子的G12D、G12A、G12V 3種突變，所用檢測探針和檢測位點的對應見表1。

圖1 檢測探針設計示意圖(N=A/T/G/C)

對探針進行通用擴增的引物序列為：Tag1:5′biotin-GGG TTC GTG GTA GAG CGT CGG AGT-3′；CTag2:5′digoxin-CCA GAC GAC ACC GAG ATA GCA GCC-3′。所有核酸序列由上海生工生物有限公司合成。

表1 檢測探針序列

1.1.3實驗試劑 2×PCR Mastermix購自天根生化科技北京有限公司，QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)購自上海葉舟生物科技有限公司，Low MW DNA Marker-A購自上海生工生物工程有限公司，Taq DNA 連接酶購自New England BioLabs，鏈親和素磁性微粒購自西安金磁納米生物技術有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1K-ras基因擴增 對K-ras基因exon2進行PCR擴增，引物為，正向引物：5′-TAA GCG TCG ATG GAG GAG TT-3′；反向引物：5′-CAT CAT GGA CCC TGA CAT AC-3′；擴增體系：標本循環DNA 5 μL，擴增引物各2.5 μL(10 pmol/μL)，去離子水5 μL ，2×Taq PCR Mastermix 15 μL。擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,36個循環；72 ℃ 4 min。擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，同時用直接測序法測定序列。

1.2.2連接反應 用4支反應管對G12S、G12R、G12C 3種突變位點進行檢測，分別標記為P-12(SRC)-C，P-12(SRC)-T，P-12(SRC)-G，P-12(SRC)-A管。另4支反應管對G12D、G12A、G12V 3種突變位點進行檢測，分別標記為P-12(DAV)-C，P-12(DAV)-T，P-12(DAV)-G，P-12(DAV)-A管。各管中分別加入10×連接反應緩沖液2 μL，模板2 μL，1 U Taq連接酶。將4組檢測探針P-12(SRC)-C/T/G/A和P-12(SRC)各2 μL(10 nmol/L) 分別加入P-12(SRC)-C/T/G/A管，同理，4組檢測探針P-12(DAV)-C/T/G/A和P-12(DAV)分別加入P-12(DAV)-C/T/G/A管，去離子水補足20 μL。另設定一空白對照管B，不加入檢測探針，其他成分與檢測管相同。各管95 ℃變性 45 s，60 ℃ 3 min，10個循環，95 ℃變性5 min。

1.2.3通用擴增 取3 μL連接反應產物，加入15 μL 2×PCR Mastermix，2 μL(5 μmol/L)通用擴增引物Tag1和CTag2，去離子水補足30 μL。擴增反應為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s，20個循環；72 ℃ 1 min。

1.2.4產物檢測 用鏈親和素磁性微粒提取純化各管通用擴增產物，將各管磁性微粒提取物對應置于96孔板中，分別加入50 μL 辣根過氧化物酶(HRP)標記抗地高辛抗體溶液，恒溫搖床中70 r/min，室溫15 min。PBST(1×)清洗3次后加入100 μL 四甲基聯苯胺(TMB)底物緩沖液，室溫顯色5 min，2 mol/L硫酸(H2SO4)終止顯色，酶標儀測定各反應管450 nm處光密度值(OD)。根據兩組反應管(OD-C、OD-T、OD-G、OD-A和OD-B)對應顯色值進行突變類型判定(若OD-B<0.05時，設定OD-B=0.05)。對G12S、G12R、G12C 3種突變位點進行檢測的OD-SRC-C、OD-SRC-T、OD-SRC-G、OD-SRC-A和OD-SRC-B 5個顯色管，若OD-SRC-C/OD-B>5，則此檢測位點為野生型；若OD-SRC-T/OD-B>5,則此檢測位點為G12S(GGT/AGT)突變；若OD-SRC-G/OD-B>5,則此檢測位點為G12R(GGT/CGT)突變；若OD-SRC-A/OD-B>5,則此檢測位點為G12C(GGT/TGT)突變。對G12D、G12A、G12V 3種突變位點的判定方法同理。

2 結 果

2.1K-ras基因外顯子擴增 各標本擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，所在泳道均有長度為511 bp的目標條帶出現，圖2顯示了對8個標本的K-ras基因外顯子2 PCR擴增產物電泳檢測結果。

圖2 K-ras基因2外顯子 PCR擴增產物凝膠電泳檢測

檢測管標本中各檢測管對應顯色值(OD?SRC)CTGAB17#1．46±0．171．02±0．090．12±0．050．15±0．030．04±0．0451#1．62±0．130．16±0．061．16±0．150．15±0．050．07±0．028#1．71±0．180．15±0．060．12±0．060．13±0．060．05±0．0232#1．81±0．110．17±0．060．16±0．050．12±0．030．07±0．0263#1．85±0．160．16±0．070．14±0．070．11±0．060．05±0．04

表3 循環DNA標本K-ras基因12位密碼子ELISA基因突變檢測結果

2.2標本檢測 利用建立的方法共檢測出3例標本存在突變。結果顯示，突變類型分別為17#標本的G12S(GGT/AGT)突變，51#標本的G12R(GGT/CGT)突變，38#標本的 G12A(GGT/GCT)突變。3例突變標本(17、51、38#)和7例野生型標本對應各檢測管的檢測值見表2、3。17、51、38#標本的野生型等位基因對應檢測管OD-C分別為1.46±0.17、1.62±0.13、1.59±0.09，突變等位基因對應檢測管OD(OD-SRC-T、OD-SRC-G、OD-DAV-G)分別為1.02±0.09、1.16±0.15、1.14±0.02。并且，對每個突變標本檢測的5個檢測管中，突變等位基因檢測管OD與非突變等位基因檢測管OD的比值(如17#標本中OD-SRC-T/OD-SRC-G和OD-SRC-T/OD-SRC-A)明顯大于5；突變等位基因檢測管OD與對照管OD-B的比值(如17#標本中，OD-SRC-T/OD-B)明顯大于10。對于非突變標本的檢測，野生型等位基因對應檢測管OD-C與其余各檢測管對應的OD值比值均明顯大于10。而通過對所有標本K-ras外顯子擴增測序后發現，在12密碼子對應測序位點均未見有明顯的提示突變的雜合套峰出現。僅在17、51、38#標本相應突變堿基處有不明顯的測序峰出現，且與背景分離不明顯，見圖3。說明直接測序方法檢測靈敏度較低，對不均一標本的突變檢測具有局限性，而新建立方法有著簡便、靈敏的特點，適合于從不均一的標本中進行突變等位基因的檢測。

圖 3 血漿循環DNA標本K-ras基因12位密碼子位點測序圖

3 討 論

K-ras基因突變是EGFR-TKIs靶向藥物治療產生耐藥性的原因之一，研究提示非小細胞肺癌中K-ras基因突變與較短的生存期及預后不良有密切聯系[9-10]。開展K-ras基因突變檢測對于肺癌、結直腸癌等腫瘤患者的個體化用藥具有重要意義。DNA測序是目前核酸突變檢測的金標準，但是靈敏度低，只有20%～50%[11-12]，不能夠有效地從腫瘤組織等不均一標本中檢測到基因突變。雖然焦磷酸測序、實時定量PCR及質譜等檢測方法具有高達1%的靈敏度[12-13]，但這些檢測方法卻要求昂貴的檢測平臺和試劑，不能夠在常規簡便實驗條件下應用。因此不適合于在基層醫療或研究機構應用。

本課題組在之前研究中建立了一種單核苷酸多態性(SNP)突變檢測方法，具有較高的檢測靈敏度，可達5%[14]。在此方法基礎上，本研究根據K-ras基因突變特點，通過巧妙設計特定檢測探針，建立了一種對K-ras基因突變檢測的新方法。進行突變檢測時，同時利用特異性檢測探針3′端堿基與突變堿基的配對識別能力和Taq DNA連接酶對錯配堿基的識別作用保證反應的高特異性。而方法的靈敏度則通過引物二次擴增及ELISA反應保證。

通過對K-ras基因12位密碼子6種突變的檢測，在72例肺癌循環DNA標本中共檢測到3例突變，分別是17#標本的G12S(GGT/AGT)突變，51#標本的G12R(GGT/CGT)突變，38#標本的 G12A(GGT/GCT)突變。然而與直接測序方法比較時，測序方法中所得測序圖譜在突變位點不能分離出明顯的突變堿基對應峰，說明直接測序法由于檢測靈敏度低，不適合于不均一的標本的突變檢測。研究表明，K-ras基因突變率在不同腫瘤類型及人群中差異較大，如白種人群結直腸癌標本中可達15%～30%，而在亞裔人群肺癌標本中突變率只有4%～10%[2,4,15-17]，與本研究中得出的突變檢測率相近。

總之，本研究建立了一種基于連接酶-ELISA反應的對K-ras基因突變檢測的方法。本方法操作簡便，無需昂貴的實驗儀器設備、試劑，在普通PCR儀、酶標儀等簡單實驗條件下即能完成。適合于在簡單實驗條件下對不均一標本進行常規突變檢測。但是，本方法不能對未知突變位點進行檢測，且有一定檢測通量的限制，不適合于進行高通量檢測。

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