CXCL10、CXCR3及T細胞亞群在進展期白癜風患者外周血中的表達及復方中藥對其影響*

鄧 莉,江 雪,王禹毅,史丙俊,劉 洋,徐 偉,刁慶春,鄭文豪△

(1.重慶市中醫院/重慶市第一人民醫院皮膚科 400000；2.西南醫科大學附屬醫院皮膚科，四川瀘州 646000)

白癜風是一種獲得性皮膚病，以黑素細胞漸進性和選擇性破壞為特征[1]。有研究認為白癜風是一種器官特異性自身免疫性皮膚病，是由細胞毒性T細胞介導對表皮中黑素細胞攻擊導致的疾病[2]。趨化因子配體10(CXCL10)是趨化因子(CXC)亞家族成員，通過與趨化因子受體3(CXCR3)結合參與了多種自身免疫性疾病的發病，如自身免疫性甲狀腺疾病、類風濕關節炎、腎炎、皮肌炎、銀屑病、紅斑狼瘡等。最近也有越來越多的研究顯示，白癜風的發病與血清中CXCL10的表達水平相關。同時也有研究認為T細胞依賴的免疫應答參與白癜風的發病及發展過程，尤其是CD8+T細胞，被認為可以直接破壞黑素細胞[3]，而輔助性T細胞(Th細胞)，大部分為CD4+T細胞，可以調節或協助免疫反應，促進白癜風皮損的好轉[4]。本研究所用的復方中藥是重慶市中醫院自主研發的純中藥制劑，已在臨床上廣泛使用，臨床療效肯定,但其治療作用機制仍不明確，因此本研究檢測白癜風患者口服該復方中藥治療前后外周血中CXCL10、CXCR3及T細胞亞群的變化，探討復方中藥對白癜風發病的免疫調控作用及機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年10月在重慶市中醫院皮膚科就診白癜風患者28例，其中男16例，女12例；年齡18～60歲，平均(39.50±12.52)歲；病程1個月至20年；皮損面積1%～5%，平均(3.13±0.86)%，均為進展期。上述28例患者治療前后采血，另選30例健康體檢者作為健康對照組，其中男14例，女16例；年齡18～60歲，平均(33.46±8.62)歲；均無免疫性疾病及系統性疾病史。納入標準：(1)符合白癜風的診斷標準；根據“白癜風診療共識2014版”“2012年白癜風全球問題共識”分類標準，進行診斷及分型；(2)符合進展期；(3)皮損VIDA評分：>1～<4分；(4)近1個月未用過抗白癜風藥物治療，未用過免疫調節劑，未用過抗白癜風物理治療；(5)2周內無外用皮質類固醇藥物史，皮損無明顯感染征象。排除標準：(1)近1個月使用激素及免疫調解劑、中藥制劑、光療患者；(2)伴有濕疹、特應性皮炎、銀屑病等其他皮膚病患者；(3)惡性腫瘤患者，妊娠或哺乳期婦女；(4)合并自身免疫性疾病患者。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2實驗試劑和儀器 RPMI 1640培養基(美國Hyclone)，人淋巴細胞分離液(上海拜力生物科技有限公司)，CXCL10 ELISA試劑盒(美國RD公司)，人CXCR3 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特公司)，酶標儀(芬蘭產全波長酶標儀 Multiskan Spectrum)。CD3-PE,CD8-APC,CD4-FITC(美國BD公司)。流式細胞儀為BD Accuri C6小型流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1用藥 口服該中藥復方(主要由黃芪、白術、川芎、合歡皮、蒺藜、鉤藤、浮萍、防風、白芷、桑枝、丹參、郁金、補骨脂、雞血藤、首烏、女貞子、旱蓮草組成，可酌情加減)，每天1劑，每次200 mL，分3次服用，療程1個月。觀察療效及不良反應，拍照留存。安全性評價：試驗組患者治療前及治療1月后均查肝腎功、血、尿、大便常規。

1.3.2標本收集 所有受試者均于治療前后清晨抽取空腹外周靜脈血10 mL 于真空采血管，取2 mL 3 000 r/min 離心5 min，分離收集上層血清，-80 ℃ 保存。另8 mL用于分離外周血單個核細胞，敷抗，固定后上機檢測。

1.3.3CXCL10及CXCR3檢測方法 血清CXCL10和CXCR3水平均采用ELISA試劑盒進行測定，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。在酶標儀450 nm處測定各孔吸光度(A)值，分析各細胞因子表達水平。樣品敷抗固定后于1周內用流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.1外周血清CXCL10及CXCR3檢測結果 白癜風患者治療前外周血清中CXCL10的表達水平明顯較健康對照組高(P<0.01)，治療后較治療前下降(P<0.05)。白癜風患者治療前外周血清中CXCR3水平較健康對照組明顯升高(P<0.01)，治療后仍明顯高于健康對照組(P<0.01)，治療后CXCR3水平較治療前無明顯變化(P>0.05)，見表1、圖1。

2.2復方中藥對外周血T細胞亞群的影響 白癜風患者治療前外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞比例低于健康對照組，差異無統計學意義(P>0.05)，CD4+/CD8+比值升高，差異無統計學意義(P>0.05)；服用復方中藥1個月后，CD3+CD4+T細胞比例較治療前升高(P<0.05)， CD3+CD8+T細胞比例較治療前顯著升高(P<0.01)，CD4+/CD8+比值較用藥前下降(P>0.05)，見表2、圖2。

表1 白癜風患者治療前、后及健康對照組外周血清CXCL10及CXCR3表達情況

a：P<0.05；b：P<0.01

圖1 CXCL10、CXCR3在治療前、后的白癜風患者及健康對照外周血中的表達

a：P<0.05；b：P<0.01

圖2 CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞在治療前后的白癜風患者及健康對照外周血中的比例

2.3不良反應及安全性評價 無明顯不良反應，治療前后肝腎功、三大常規檢測結果均正常。

3 討 論

中醫治療白癜風已有幾千年歷史，療效肯定，但辨證分型較為復雜。筆者根據文獻總結及歷代醫家治療經驗，認為白癜風常虛實夾雜為患，白癜風患者素體肝腎虧虛，風邪挾瘀阻絡而致病。進展期白癜風皮損逐漸擴大、增多，可伴癢感，這些臨床癥狀與風邪善行而數變的致病特點吻合，因此進展期白癜風“風邪挾瘀”是其主要病理機制，以祛風散邪為主要治法，兼以養血活血、滋補肝腎。本課題組前期已開展了白癜風中藥復方對豚鼠白癜風模型的治療作用研究，實驗觀察到中藥復方對豚鼠白癜風模型有較好的復色作用，能夠促進黑色素的增多，說明本方對白癜風治療有效，但其內在作用機制目前尚不清楚[5]。現代中藥藥理研究認為黃芪、白術、防風具有良好的免疫調節功能，補益藥物女貞子、旱蓮草對酪氨酸酶具有較強的激活作用[6]。光敏藥物補骨脂、白芷能增強皮膚對紫外光的敏感性，從而加速黑素的生物合成。CXCL10、CXCR3及T細胞亞群均是機體免疫系統的重要組成部分，本研究所用的中藥成分大部分具有調節免疫的功能，實驗結果也證實了本實驗所用的復方中藥有調節免疫的作用。同時治療前后所有患者肝腎功、三大常規結果均正常，說明本研究所用復方中藥具有較好的安全性。

CXCL10是CXC亞家族趨化因子，最新的研究顯示在CXC亞類趨化因子家中，CXCL10與白癜風關系最為密切。RASHIGHI等[7]研究發現白癜風患者皮損和血清中CXCL10升高，并且通過白癜風小鼠模型說明CXCL10在白癜風疾病進展和維持中發揮關鍵作用。WANG等[8]發現非節段型進展期白癜風患者血清中CXCL10明顯升高，外周血單個核細胞中CXCR3 mRNA也明顯升高，而白癜風的發病最終階段是細胞毒性T細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)遷移至皮膚，殺傷表皮中的黑素細胞，由此說明CXCL10/CXCR3信號軸可能參與將CD8+T細胞募集至皮膚的過程，并認為血清CXCL10可能是一個新的監測疾病活動的生物標記，對白癜風的治療有一定的指導意義。目前少有CXCL10/CXCR3信號軸與白癜風相關性的研究，本實驗進行此研究的同時還探討了復方中藥對這一機制的干預作用。結果顯示，白癜風患者治療前血清中CXCL10及CXCR3水平均明顯高于健康對照組，與既往研究結果一致。在使用復方中藥治療1個月后 CXCL10水平明顯下降，提示本研究使用的復方中藥能通過調控CXCL10，進而阻斷CXCL10/CXCR3信號軸，促進白癜風患者皮損的穩定及好轉。至于CXCR3的表達水平無明顯變化，可能由于CXCR3主要表達在Th1細胞表面，在血清中的分泌表達較少。

CD4+、CD8+T細胞為T細胞兩個主要的亞群，CD4+T細胞活化后主要分化為Th細胞,CD8+T細胞活化后主要分化為CTL。Th細胞能分泌多種細胞因子，對機體的特異性免疫及非特異性免疫均有重要的調節作用。CTL可高表達皮膚淋巴細胞相關抗原(CLA)，招募T細胞向皮膚歸巢，導致CTL到達皮膚后直接參與黑素細胞特異性的殺傷過程。DWIVEDI等[4]研究顯示白癜風患者外周血中CD4+/CD8+細胞比值明顯低于健康對照組，說明白癜風的發病可能與免疫調節系統失衡有關。ANTELO等[9]研究顯示白癜風患者外周血中CD8+T細胞明顯下降，可能與患者皮損及皮損周圍中CD8+T細胞增加有關。SANDOVAL-CRUZ等[10]研究也發現白癜風患者皮損邊緣處皮膚活檢T細胞比率明顯高于非皮損處，且大部分為CD8+T細胞。本研究結果顯示白癜風患者外周血中CD4+、CD8+T細胞在數量上低于健康對照組，與既往研究結果一致，但差異無統計學意義(P>0.05)，可能與樣本量太少有關，適當增加樣本量之后可能會有顯著差異。治療后患者外周血中CD4+、CD8+T細胞數量較治療前顯著增多，并更加接近健康對照組水平，說明本實驗所用復方中藥對CD4+、CD8+T細胞具有一定的調節作用。

綜上所訴，CXCL10及CXCR3的高表達可以促進白癜風皮損的發生和進展，外周血CD4+T細胞比例降低、皮損中CD8+T細胞比例升高也與白癜風的發病有關。服用復方中藥治療1個月后，CXCL10及CXCR3的表達水平顯著下降，外周血中CD4+、CD8+T細胞的細胞比例升高，由此推測本研究所用復方中藥可能主要是通過調節機體細胞免疫功能發揮作用。

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