維生素D聯(lián)合葛根素對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制*

韋斯軍，黃干榮，曾海生，周歧驥，莫昕瑩,徐靈源，廖作莊

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院桂西地區(qū)微生物感染研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西百色 533000)

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的病理結(jié)構(gòu)改變，其實(shí)質(zhì)是在各種致病因素的作用下，肝臟星狀細(xì)胞合成的細(xì)胞外基質(zhì)明顯增加，超出了肝臟自身的降解能力[1-2]。四氯化碳(CCl4)是一種十分經(jīng)典的肝纖維化造模毒物，大量應(yīng)用于基礎(chǔ)研究[3]。有研究從體內(nèi)證實(shí)維生素D能降低肝臟纖維化，從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)維生素D能減少肝臟星狀細(xì)胞膠原纖維的分泌[4]。也有文獻(xiàn)報(bào)道葛根素能改善肝纖維化，其可能與下調(diào)TNF-α信號(hào)通路降低肝星狀細(xì)胞活化有關(guān)[5-6]。可見，維生素D與葛根素單獨(dú)使用具有抑制纖維化的效果，其作用機(jī)制有一定的交叉重疊，均與抑制肝星狀細(xì)胞的活化及其膠原纖維的分泌有關(guān)。但二者聯(lián)合是否能增強(qiáng)抗肝纖維化的作用未有報(bào)道，因此本研究用CCl4肝纖維化大鼠模型，探討維生素D聯(lián)合葛根素對(duì)肝纖維化的作用效果及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠50只，周齡相近，體質(zhì)量200 g左右，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。CCl4為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。維生素D與葛根素購于Sigma公司，玉米油購于和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，天狼星紅染色液購于北京雷根生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于瑞士Roche公司，核因子-κB(NF-κB)和腫瘤壞死因子(TNF-α)抗體購于美國Santa cruze公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.2方法 將Wistar大鼠50只分為5組。CCl4組，按照3 mL/kg的比例腹腔注射45% CCl4玉米油溶液，每周2次；正常對(duì)照組(C組)，給予等量的生理鹽水，腹腔注射，每周2次；維生素D組(V組)、葛根素組(P組)及維生素D聯(lián)合葛根素組(V+P組)為相應(yīng)藥物干預(yù)組，在CCl4玉米油溶液造模基礎(chǔ)上分別按照維生素D 2.0 μg/kg、葛根素0.4 g/kg、維生素D 2.0 μg/kg與葛根素0.4 g/kg的比例灌胃，每周2次。每次灌喂之前禁食1 h，C組在實(shí)驗(yàn)中灌胃等量生理鹽水。共8周，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的前1晚禁食過夜。第2天處死大鼠，取全血，室溫靜置20 min，以5 000 r/min離心15 min，取上清液，得到血清，用試劑盒檢測(cè)血中透明質(zhì)酸(HA)。取大鼠肝臟，用試劑盒檢測(cè)肝臟中的羥脯氨酸(Hyp)。一部分肝臟用多聚甲醛溶液固定，常規(guī)制備石蠟切片，進(jìn)行天狼星紅染色，顯微鏡下觀察肝臟組織切片的病理變化及纖維化的嚴(yán)重程度。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膠原蛋白(Collagen) Ⅰ、Ⅲ mRNA及Western blot檢測(cè)NF-KB和TNF-α蛋白水平。

表1 引物名稱及序列

F:正向引物;R:反向引物

2 結(jié) 果

2.1血和肝生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果 HA是分布于肝細(xì)胞周圍的一種蛋白多糖，肝纖維化時(shí)血中水平明顯增加[7]。肝臟中的Hyp是肝臟膠原纖維的重要組成部分，纖維化發(fā)生時(shí)肝臟中水平也明顯增加[8]。因此這兩者是肝纖維的重要診斷指標(biāo)。CCl4組的HA和Hyp均明顯高于C組，一定程度上表明肝纖維化模型建立成功。V組、P組及V+P組的HA和Hyp水平相對(duì)于CCl4組明顯降低，而且V+P組降低得最為明顯，見表2。

表2 血液與肝臟生化指標(biāo)

a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

2.2肝臟組織病理切片觀察結(jié)果 大鼠肝組織纖維化面積CCl4組最大，C組最小(P<0.05)，各給藥組中V+P組纖維化面積最小，見圖1。

A:C組；B:CCl4組；C:V組；D：P組；E:V+P組；F:天狼星紅染色陽性面積統(tǒng)計(jì)圖；a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

圖1 天狼星紅染色切片(×200)

續(xù)表3 肝臟Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平

a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

2.3肝臟Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平 大鼠肝臟Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平，CCl4組最高，C組最低(P<0.05)，各給藥組中V+P組Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平最低，見表3。

2.4肝臟TNF-α與NF-κB蛋白水平 大鼠肝臟TNF-α與NF-κB蛋白水平，CCl4組最高，C組最低(P<0.05)，各給藥組中V+P組NF-κB蛋白水平最低，P組與V+P組TNF-α比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

A:Western blot檢測(cè)肝臟TNF-α與NF-NF-κB蛋白水平；B:TNF-α灰度分析；C:NF-κB灰度分析。a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

圖2肝臟TNF-α與NF-κB蛋白水平比較

3 討 論

肝纖維化是慢性肝疾病在進(jìn)程中不可避免的病理改變，若不阻斷其進(jìn)程，進(jìn)一步發(fā)展就會(huì)演變?yōu)楦斡不８卫w維化的致病因素十分多樣，如病毒、寄生蟲、酒精及其他一些毒物包括CCl4。其實(shí)質(zhì)可以歸納為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞外的細(xì)胞外基質(zhì)的生成與降解的平衡紊亂，這些細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)不斷積聚，其中最主要的成分就是膠原纖維[9]。而肝星狀細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)生成與降解的主要參與者，因此其活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。

維生素D大部分通過肝臟合成，而且肝臟本身也是其作用的靶器官之一。文獻(xiàn)報(bào)道維生素D可以改善CCl4導(dǎo)致的大鼠纖維化，而且離體實(shí)驗(yàn)表明可能與其降低肝星狀細(xì)胞活化與膠原纖維分泌減少有關(guān)。葛根素作為一種被大量應(yīng)用于臨床的黃酮類藥物，有研究表明其也能降低CCl4導(dǎo)致的肝纖維化，其中NF-κB/TNF-α信號(hào)通路是被抑制的，但葛根素與維生素D聯(lián)用后該信號(hào)通路是否也被明顯抑制未見報(bào)道。由于大量文獻(xiàn)報(bào)道氧化應(yīng)激與肝纖維化密切相關(guān)，且NF-κB/TNF-α信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞活化中起著十分重要的作用[10]，所以，無論是單用維生素D還是葛根素，在肝纖維化過程中保護(hù)肝臟都與抑制肝星狀細(xì)胞的功能密切相關(guān)，這提示二者聯(lián)用可能會(huì)發(fā)揮更大保護(hù)作用。

維生素D和葛根素均能明顯降低大鼠HA及肝臟中的Hyp水平，使得大鼠肝臟膠原纖維明顯降低。維生素D聯(lián)合葛根素對(duì)各種損傷指標(biāo)的降低及膠原纖維沉積的改善最為明顯，從而證實(shí)了二者有協(xié)同作用，聯(lián)用對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用更明顯。

肝臟纖維化的實(shí)質(zhì)是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的生成增加而降解減少。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原纖維，而 Collagen Ⅰ、Ⅲ是膠原纖維的主要存在形式，大部分是由肝星狀細(xì)胞合成[11]。在肝纖維化的進(jìn)程中，NF-κB和TNF-α是重要的信號(hào)分子。TNF-α介導(dǎo)下游NF-κB的激活，而NF-κB在肝星狀細(xì)胞的活化過程中發(fā)揮極其重要的作用[12]。維生素D和葛根素均能降低這些分子的mRNA及蛋白水平，維生素D聯(lián)合葛根素的降低作用同樣最為明顯。以上研究提示維生素D聯(lián)合葛根素在肝纖維化過程的保護(hù)作用是降低肝星狀細(xì)胞的活化及其膠原纖維的分泌。

本項(xiàng)研究探討了維生素D聯(lián)合葛根素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠纖維化的保護(hù)作用，其聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥抗肝纖維化效果更好，并初步探究了其機(jī)制與Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA及NF-κB和TNF-α的蛋白水平增加有關(guān)，這對(duì)臨床實(shí)踐有一定的參考價(jià)值。但調(diào)控途徑往往由多因子、多路徑參與，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

[1]馬志剛，陳蘭，詹靈凌，等．Wnt信號(hào)通路調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化及增殖在肝纖維化治療中的研究進(jìn)展[J]．世界華人消化雜志，2014，22(21)：3048-3055．

[2]FRIEDMAN S L.Molecular regulation of hepatic fibrosis,an integrated cellular response to tissue injury[J].J Biol Chem,2000,275(4):2247-2250.

[3]魏曉光，郭輝，陳永珍，等．腹腔注射CCl4建立大鼠肝纖維化模型[J]．實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2015，34(11)：34-37．

[4]ABRAMOVITCH S,DAHAN-BACHAR L,SHARVIT E A,et al.Vitamin D inhibits proliferation and profibrotic marker expression in hepatic stellate cells and decreases thioacetamide-induced liver fibrosis in rats[J].Gut,2011,60(12):1728-1737.

[5]LI R,XU L Y,LIANG T,et al.Puerarin mediates hepatoprotection against CCl4-induced hepatic fibrosis rats through attenuation of inflammation response and amelioration of metabolic function[J].Food Chem Toxicol,2013,52(2):69-75.

[6]KAJI K,YOSHIJI H,IKENAKA Y,et al.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor attenuates hepatic fibrosis via suppression of activated hepatic stellate cell in rats[J].J Gastroenterol,2014,49(3):481-491.

[7]肖蕾，王云蓮，艾力江·吐爾遜，等．血清透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白與大鼠放射性肝纖維化的相關(guān)性研究[J]．中華全科醫(yī)學(xué)，2015，13(1)：18-20．

[8]王者令，劉中景，宋霆，等．扶正活血不同組方對(duì)肝纖維化大鼠相關(guān)血清指標(biāo)及肝組織羥脯氨酸的影響[J]．中藥新藥與臨床藥理，2010，21(6)：611-613．

[9]LU J,CHEN B A,LI S L,et al.Tryptase inhibitor APC 366 prevents hepatic fibrosis by inhibiting collagen synthesis induced by tryptase/protease-activated receptor 2 interactions in hepatic stellate cells[J].Int Immunopharmacol,2014,20(2):352-357.

[10]WANG Y,ZHAO Z,YAN Y,et al.Demethyleneberberine protects against hepatic fibrosis in mice by modulating NF-κB signaling[J].Int J Mol Sci,2016,17(7):1036.

[11]FRIEDMAN S L,BANSAL M B.Reversal of hepatic fibrosis:fact or fantasy?[J].Hepatology,2006,43(1):82-88.

[12]趙宗豪，梅俏，吳軍，等．核轉(zhuǎn)錄因子-κB與大鼠肝纖維化關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J]．安徽醫(yī)學(xué)，2003，24(5)：1-3．