Tubacin對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能的影響*

盧 芳，周艷芳△，彭新生，張琛琛，梁嘉強(qiáng)

(廣東醫(yī)科大學(xué)：1.病理生理學(xué)教研室；2.藥劑學(xué)教研室，東莞 523808)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)易于分離培養(yǎng)且免疫排斥弱，被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療等組織工程學(xué)研究[1]，然而移植的外源性BMSCs在體內(nèi)損傷部位存活率低、生物分布十分有限，極大地阻礙了其臨床應(yīng)用，因此提高干細(xì)胞移植效率是目前迫切需要解決的問題之一。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)通過去乙酰化修飾，在染色質(zhì)重構(gòu)，基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)功能調(diào)控中起重要作用。最近研究表明，HDAC6參與腦損傷的發(fā)生、發(fā)展，而HDAC6抑制劑tubacin不僅參與腦損傷后抗炎抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)再生等保護(hù)機(jī)制，還可誘發(fā)干細(xì)胞激活并向受損區(qū)域遷移，促進(jìn)腦缺血區(qū)域神經(jīng)和血管新生[2-3]。本研究利用AFM對(duì)tubacin處理后的BMSC形貌和表面超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，以期更深入地了解tubacin對(duì)BMSC形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變及其與細(xì)胞遷移之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 幼年雄性清潔級(jí)SD大鼠2只，體質(zhì)量約80～100 g，用于BMSCs原代培養(yǎng)(由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑及儀器 原子力顯微鏡(AFM,NanoScope-V，Veeco instruments，美國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國)，DMEM/F12液體培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶(Gibco,美國)，tubacin(Sigma，美國)，戊二醛(南京森貝伽生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離及培養(yǎng) 大鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75%乙醇消毒20 min。無菌操作原則下迅速剝離雙側(cè)脛骨及股骨，清除殘余肌肉和結(jié)締組織，保持骨膜及干骺端完整。無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍后剪去雙側(cè)干骺端，用5 mL一次性注射器抽取DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，盡量將骨髓組織全部沖出。隨后將骨髓組織沖洗液移入15 mL離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液5 mL，輕輕吹打混勻后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后首次全量換液，保留貼壁細(xì)胞，之后隔天換液，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min后按1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)tubacin對(duì)BMSCs活力的影響 取指數(shù)生長期的BMSCs，0.25%胰酶消化離心收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋成2×104/mL的細(xì)胞懸液，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)每孔約含細(xì)胞2 000個(gè)，設(shè)置調(diào)零組，對(duì)照組，不同濃度(0.25、0.50、0.75、1.00、2.00 μmol/L tubacin)藥物處理組，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，各組添加含不同濃度tubacin的培養(yǎng)基200 μL，陰性對(duì)照組添加相同體積的無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL濃度5 g/L 的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO)，結(jié)晶溶解后在波長490 nm的酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收(A)值。按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，As：實(shí)驗(yàn)孔吸光度值；Ac：對(duì)照孔吸光度值；Ab：空白孔吸光度值。

1.2.3AFM樣品制備與成像 收集生長良好的第4代BMSCs，調(diào)整密度至2×105/mL接種于35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后各組分別加入含不同濃度tubacin的培養(yǎng)基，24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次后用1%戊二醛固定細(xì)胞10 min，隨后PBS洗3次，最后三蒸水洗滌2次，室溫自然晾干。AFM在空氣中采用接觸模式對(duì)樣品進(jìn)行觀察，ScanAsyst成像，Scanasyst-Air型探針，設(shè)置256個(gè)采樣點(diǎn)，掃描速率為0.7 Hz。AFM圖像全部經(jīng)過自帶軟件(Nanoscope Analysis)平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。AFM力譜用于分析力曲線計(jì)算楊氏模量，所有力曲線都在同一加載速率測(cè)得。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞呈圓形，大小不一，胞體透亮懸浮于培養(yǎng)液中，首次換液后觀察到部分細(xì)胞開始貼壁，呈圓形、梭形或多角形，以后貼壁細(xì)胞逐漸增多，6 d左右細(xì)胞融合80%～90%。消化傳代12 h后大部分細(xì)胞貼壁，鏡下觀察BMSCs多呈長梭形或星形，細(xì)胞質(zhì)豐富，核大而清晰，折光性好。細(xì)胞生長旺盛，每5天可傳代1次，經(jīng)過第1、2次傳代后，細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀同向排列，形態(tài)趨于一致，見圖1。

A:原代培養(yǎng)第4天;B:原代培養(yǎng)第6天;C:第3代細(xì)胞;D:第4代細(xì)胞

圖1不同時(shí)期的BMSC形態(tài)學(xué)觀察(×40)

圖2 不同濃度tubacin作用于BMSC 24 h后的細(xì)胞存活率

A、D：對(duì)照組；B、E：0.25 μmol/L tubacin組；C、F：0.50 μmol/L tubacin組

圖3 BMSC的二維、三維形貌圖

A、D：對(duì)照組；B、E：0.25 μmol/L tubacin組；C、F：0.50 μmol/L tubacin組

圖4 BMSC高度直徑圖

A、D、G：對(duì)照組；B、E、H：0.25 μmol/L tubacin組；C、F、I：0.50 μmol/L tubacin組

圖5 BMSC超微結(jié)構(gòu)及膜表面粒徑分布圖

2.2MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比，tubacin處理24 h后細(xì)胞存活率顯著提高，以0.50 μmol/L tubacin組作用最為明顯，存活率高達(dá)180%，當(dāng)tubacin濃度提高到1.00 μmol/L以上時(shí)，細(xì)胞存活率下降，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTT結(jié)果表明，低濃度tubacin具有促BMSC增殖作用，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0.25 μmol/L和0.50 μmol/L的tubacin作下一步細(xì)胞預(yù)處理，見圖2。

2.3BMSC的AFM觀察 AFM不僅有納米級(jí)的高分辨率，而且能在高分辨率基礎(chǔ)上觀察樣品的三維結(jié)構(gòu)。應(yīng)用AFM獲得低濃度tubacin 預(yù)處理細(xì)胞的二維和三維圖像，見圖3。根據(jù)隆起的邊緣可清楚辨別細(xì)胞位置和細(xì)胞質(zhì)界限，BMSC以梭形為主，胞核大而清晰，絲狀偽足形成毗鄰細(xì)胞之間的網(wǎng)狀連接。圖4顯示對(duì)照組細(xì)胞直徑為43.7 μm，高度在20～100 nm之間，0.25 μmol/L tubacin處理組細(xì)胞直徑為70.4 μm，高度在50～200 nm之間，0.50 μmol/L tubacin處理組細(xì)胞直徑為81.4 μmol/L，高度在80～200 nm之間。結(jié)果顯示,隨著tubacin濃度的增加，細(xì)胞變得更狹長，擁有更長而豐富的偽足。圖5A～F為BMSC膜表面5 μm×5 μm的超微結(jié)構(gòu)圖。對(duì)照組細(xì)胞膜表面粗糙不平整，有明顯孔洞和凹陷，表面顆粒分布不均，堆積松散，高度多集中在50～200 nm(圖5G)。隨著tubacin濃度的增加，細(xì)胞表面更為光滑，顆粒分布均勻，大小在10～600 nm(圖5H、I)，表面顆粒連接緊密，或成團(tuán)聚集(圖5B)，或呈條索狀排列(圖5C)。各實(shí)驗(yàn)組分別選取10個(gè)1 μm×1 μm的膜表面超微結(jié)構(gòu)區(qū)域，用NanoScope Analysis軟件進(jìn)行測(cè)量，得到各組細(xì)胞膜表面粗糙度，結(jié)果顯示tubacin處理組的細(xì)胞膜表面均方根粗糙度(Rq)及平均粗糙度(Ra)較對(duì)照組明顯降低，見表1、圖6。AFM可測(cè)量力-距離曲線用于分析各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜的機(jī)械性能，本實(shí)驗(yàn)測(cè)量的區(qū)域?yàn)? μm×1 μm，每個(gè)區(qū)域測(cè)量256條力曲線，每個(gè)細(xì)胞測(cè)量5個(gè)不同區(qū)域，各組分別測(cè)量10個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。楊氏模量反映細(xì)胞膜表面的剛性，楊氏模量越大,細(xì)胞越不易發(fā)生形變。圖6為各組細(xì)胞楊氏模量對(duì)比，隨著tubacin濃度的增加，楊氏模量逐漸增大，說明與對(duì)照組相比，tubacin處理后細(xì)胞骨架排列更為緊密，抗形變能力增強(qiáng)，可承受更多的機(jī)械應(yīng)力。

表1 各組BMSC膜表面Rq及Ra統(tǒng)計(jì)

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖6 BMSCs膜表面粗糙度

A:對(duì)照組；B:0.25 μmol/L tubacin組；C:0.50 μmol/L tubacin組

圖7楊氏模量統(tǒng)計(jì)分布圖

3 討 論

近年來，大量研究證實(shí)HDAC在細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用[4-5]，HDAC6是HDACs家族中最獨(dú)特的成員，擁有2個(gè)鋅指催化結(jié)構(gòu)域，可特異性催化非組蛋白底物,參與調(diào)節(jié)眾多生理病理進(jìn)程。在胞內(nèi)，HDAC6通過與α微管蛋白(α-tubulin)、皮層肌動(dòng)蛋白(cortactin)、熱休克蛋白90(HSP90)等底物蛋白相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[6]。

細(xì)胞的形貌結(jié)構(gòu)與其生理狀態(tài)和功能密切相關(guān)，細(xì)胞膜上分布的糖類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等各類生物大分子，不僅保持著細(xì)胞膜的完整性，還負(fù)責(zé)傳遞細(xì)胞信號(hào)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞間相互作用[7]，膜結(jié)構(gòu)的改變被認(rèn)為與細(xì)胞遷移、黏附密切相關(guān)[8-9]。本研究中，經(jīng)tubacin處理的BMSC呈長梭形延伸鋪展，擁有更豐富的偽足，這既有利于細(xì)胞間的信息傳遞，又能增加細(xì)胞與基底接觸面積，從而增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[10]。膜表面粗糙度也是細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，它被證實(shí)與細(xì)胞骨架的完整性有關(guān)[11]。本研究中，tubacin處理后的細(xì)胞膜表面顆粒高度增加，粗糙度下降，這可能是細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)等大分子增加和細(xì)胞內(nèi)部骨架重新排列共同作用的結(jié)果。

細(xì)胞遷移是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，首先細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前端向遷移方向伸出偽足，與基質(zhì)黏附并向前移動(dòng)，同時(shí)細(xì)胞后緣回縮，與基質(zhì)分離，這幾個(gè)步驟循環(huán)重復(fù)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)部不斷進(jìn)行骨架重排，結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化[12-13]。細(xì)胞硬度可直接反應(yīng)細(xì)胞骨架的構(gòu)成，硬度高的細(xì)胞內(nèi)部骨架排列更為緊密，在遷移過程中可承受更大外力并保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性[14]。此外，增加硬度還能為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)的伸展、回縮提供更強(qiáng)大驅(qū)動(dòng)力，幫助維持運(yùn)動(dòng)方向，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力[15]。AFM力學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明tubacin處理組細(xì)胞楊氏模量更大，硬度增加，機(jī)械性能增強(qiáng)，有助于提升細(xì)胞遷移效率。

本研究結(jié)果提示，低濃度tubacin可促進(jìn)BMSC增殖，引起細(xì)胞形貌及膜表面超微結(jié)構(gòu)改變，增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械性能，有助于提高細(xì)胞移植治療效率。本課題組將進(jìn)一步檢測(cè)低濃度tubacin對(duì)BMSC遷移、黏附能力的影響及其潛在作用機(jī)制，為干細(xì)胞移植療法提供新思路。

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