miR-208b-3p在右美托咪定減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用研究*

楊馮睿，易 漢，汪 超，楊 歡，胡嘯玲

(南華大學附屬第一醫院麻醉科，湖南衡陽 421001)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)在心肺復蘇、心肌梗死溶栓、介入治療及心臟移植中時有發生，由此引發的心律失常、心力衰竭和再梗死等并發癥不僅影響了治療效果，也給患者生命造成了嚴重威脅[1]。因此探索防治MIRI的藥物及靶點具有重要意義。研究發現右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)具有改善缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的作用[2-3]，但具體機制尚不清楚。研究發現木犀草素可通過下調miR-208b-3p水平來抑制大鼠的MIRI，而過表達 miR-208b-3p水平可加重MIRI癥狀，提示miR-208b-3p在MIRI發生、發展中發揮促進作用[4]。本研究擬觀察miR-208b-3p是否影響DEX對MIRI的改善作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 DEX購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，miR-208b-3p模擬物(miR-208b-3p mimics，miRNA mimics是針對miRNA的成熟體設計并合成的小片段雙鏈miRNA，作用與miRNA的成熟體一樣，可以上調細胞內相應miRNA的含量)購自百奧邁科生物技術有限公司，肌鈣蛋白(cTn-Ⅰ)、肌酸激酶(CK-MB)檢測試劑盒購自碧云天生物科技公司，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司，Bax、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和Bcl-2一抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

表1 各組大鼠的心功能指標比較

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

1.2.1分組 將成年雄性Wister大鼠(體質量為280～320 g)80只分為假手術(Sham)組、I/R組、DEX組和miR-208b-3p+DEX組(n=20)。Sham組：冠狀動脈左前降支只穿線，不結扎；I/R組：結扎冠狀動脈左前降支45 min，再灌注120 min，再灌注前10 min由股靜脈緩慢注入生理鹽水(1 mL/100 g)；DEX組在I/R前經股靜脈注射5 μg/kg負荷劑量的DEX，然后以5 μg·kg-1·h-1持續輸注1 h，miR-208b-3p+DEX組在I/R前24 h心肌內注射miR-208b-3p模擬物(miR-208b-3p mimics，1×103mol/L)，DEX用法同DEX組。本實驗所用大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于無特定病原體(SPF)級實驗動物房中，濕度控制在60%～70%，室溫為(22±1)℃，照明晝夜明暗交替時間為12 h∶12 h。

1.2.2血流動力學指標測定 I/R 120 min后經右側頸總動脈插管至左心室，連接至八導生理記錄儀，記錄心率(heart rate，HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左心室變化速率最大值(±dp/dtmax)。

1.2.3血清CK-MB和cTn-Ⅰ水平測定 I/R 120 min后收集右頸總動脈血4 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，分離出血清，分別用全自動生化分析儀和ELISA法測血清CK-MB活性和cTn-Ⅰ水平。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.4心肌凋亡細胞原位測定 嚴格按照TUNEL凋亡測試試劑盒說明書操作。光鏡下正常心肌細胞核呈藍色，棕色為TUNEL 染色陽性細胞，每張切片隨機選取10個視野(×400倍)，計數凋亡陽性細胞，以凋亡細胞個數/所有細胞個數作為凋亡指數(apoptotic index，AI)，AI反映各組心肌細胞凋亡的情況。

1.2.5心肌氧化相關指標檢測 I/R 120 min 后取大鼠左心室結扎線以下心尖部缺血區心肌組織，每20 mg組織加入150 μL裂解液，與生理鹽水混合后研磨勻漿，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min，取上清液；硫代巴比妥酸法測定MDA水平，試劑盒法檢測谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。

1.2.6心肌凋亡相關蛋白的表達情況 I/R 120 min 后取大鼠左心室結扎線以下心尖部缺血區心肌組織，于液氮中迅速冷凍后研磨，制備勻漿后檢測蛋白含量，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉后，給予Bax、Bcl-2和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)的一抗孵育，TBST洗膜后孵育二抗，經曝光顯影后進行數據分析，最終結果表示為目的蛋白與內參光密度的比值。

2 結 果

2.1各組大鼠的心功能指標比較 與Sham組比較，I/R組LVSP、-dp/dtmax和+dp/dtmax降低，LVEDP升高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的LVSP、-dp/dtmax和+dp/dtmax均升高，LVEDP降低(P<0.05)；miR-208b-3p mimics可降低DEX對I/R大鼠心功能的改善效果，見表1。

2.2各組大鼠血清cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI比較 與Sham組比較，I/R組的cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI均升高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI均降低(P<0.05)；與DEX組比較，miR-208b-3p+DEX組cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI均升高，見表2。

表2 各組大鼠血清 cTn-Ⅰ、CK-MB水平及AI比較

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

2.3各組大鼠心肌組織中的氧化應激相關指標比較 與Sham組比較，I/R組的GSH-Px、T-AOC及SOD活性均降低，MDA水平升高(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的GSH-Px、T-AOC及SOD活性均升高，MDA水平降低(P<0.05)；miR-208b-3p mimics可降低DEX對I/R大鼠心肌氧化應激指標的改善效果，見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中的氧化應激相關指標比較

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

2.4各組大鼠肌凋亡相關基因表達的比較 與Sham組比較，I/R組的Bax、Caspase-3水平均升高，Bcl-2水平降低(P<0.05)；與I/R組比較，DEX組的Bax、Caspase-3水平均降低，Bcl-2水平升高(P<0.05)；miR-208b-3p mimics可降低DEX對I/R大鼠心肌Bax、Caspase-3和Bcl-2的改善效果。見表4。

表4 各組大鼠心肌凋亡相關基因的表達情況

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與DEX組比較

3 討 論

MIRI是指在心肌缺血基礎上恢復血流后組織細胞功能代謝障礙及結構功能破壞反而加重，甚至發生不可逆性損傷的現象[5]。近年來，MIRI的發生機制已得到深入研究。目前公認的是細胞凋亡與MIRI及I/R過程密切相關[6]。大量證據顯示，在許多器官和組織中抗凋亡的調節與許多基因的調節有關，包括Bcl-2家族、Caspase家族、p53和核因子-κB。心肌細胞的凋亡是MIRI的關鍵細胞事件[7-8]，越來越多的研究都集中在如何減輕心肌細胞凋亡。

多項研究的結果表明，給予DEX處理對發生I/R損傷的心肌細胞有較好的保護作用。秦智剛等[9]發現DEX能在一定程度上減輕體外循環下的MIRI，其機制可能與其抗氧化應激作用有關。吳志林等[10]發現DEX定可通過抗氧化應激，降低炎性反應而減輕大鼠MIRI。但DEX改善MIRI的機制目前尚不清楚。

microRNAs對發生IRI心肌細胞的凋亡有較好的調控作用。其中miR-208b-3p具有促凋亡作用[4]，且研究發現下調其水平可減輕IRI。本研究發現I/R組出現心功能異常，而給予DEX處理后以上指標獲改善，以上結果表明I/R模型制備成功，且DEX具有較好的心肌I/R損傷保護作用。

本研究進一步采用過表達miR-208b-3p發現DEX對MIRI的改善效果被逆轉，表明DEX可通過下調miR-208b-3p水平來發揮對MIRI的保護作用。miR-208b-3p是一種促凋亡蛋白，本研究發現過表達miR-208b-3p處理后導致Bax和Caspase-3水平升高，Bcl-2水平降低，提示miR-208b-3p可能通過促進凋亡相關蛋白表達來逆轉DEX對MIRI的改善效果。多項研究指出氧化應激也是導致MIRI的原因之一[11-12]，本研究發現過表達miR-208b-3p后可導致GSH-Px、T-AOC及SOD活性均降低，MDA水平升高，表明miR-208b-3p可影響DEX對氧化應激的改善效果。

綜上所述，過表達miR-208b-3p可消除DEX對心肌I/R損傷的保護作用，提示miR-208b-3p可能參與了I/R損傷的發生、發展。

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