外源性NPM突變蛋白對AKT細胞定位的影響及其對白血病增殖的意義*

全 靜，王 春，李寶林，劉靳波

(1.西南醫科大學附屬醫院檢驗科，四川瀘州 646000；2.四川省瀘州市中醫醫院檢驗科 646000)

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)主要定位于細胞的核仁顆粒區，屬核質穿梭蛋白，它廣泛存在于各種組織細胞中，結構高度保守，是一種重要的伴侶分子[1]。A型突變(NPM mutant A,NPM mA)是NPM最為常見的突變類型，占75%～80%[2]。白血病是一組造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病，在治療上具有明顯的異質性，NPM突變在臨床上與白血病發生發展密切相關[3]。研究表明，突變后的NPM蛋白可攜帶抑癌蛋白p19ARF[4]、NF-kappa B[5]、c-myc[6]等核內蛋白發生胞質移位，通過影響其穩定性從而促進白血病細胞的惡性增殖。白血病發生、發展中存在蛋白激酶B(protein kinase B,AKT) 信號通路的過度激活，與白血病細胞存活、轉化和黏附等生物學功能密切相關[7]。本研究旨在探討外源性NPM mA與AKT的相互關系，以及NPM mA對AKT的亞細胞定位的影響，并進一步觀察NPM mA與AKT對白血病細胞增殖的意義，從而深入認識NPM突變蛋白在白血病發生、發展中的機制。

1 材料與方法

1.1質粒與細胞 MSCV-IRES-GFP、MSCV-Flag-NPM wt和MSCV-Flag-NPM mA質粒由美國圣猶大兒童研究醫院惠贈，HA-AKT、pEnvelope 和 pHelp質粒由美國安德森癌癥研究中心惠贈，人慢性粒細胞白血病細胞株K562和人胚腎HEK293T細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.2藥品與試劑 胎牛血清(FBS,上海普飛生物技術有限公司)；RPMI 1640、DMEM培養基(Gibco-BRL公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；兔抗人NPM mA單克隆抗體(Abcam公司)；小鼠抗人NPM單克隆抗體、Protein A/G beads(Santa Cruz公司)；小鼠抗Flag標簽抗體、小鼠抗HA標簽抗體、兔抗人AKT單克隆抗體(Cell Signal Technology公司)；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、FITC標記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor?594山羊抗鼠IgG、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(德國Roche公司)；AKT抑制劑(AKT inhibitor Ⅳ，AKT Ⅳ；Calbiochem公司)；CCK8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 HEK293T細胞用含10% FBS的DMEM培養基，K562細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養基，培養于5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2細胞轉染 已知NPM1基因是雜合性突變，人K562和HEK293T細胞株均存在野生型NPM蛋白，不存在NPM mA。本研究中K562細胞設立空載體轉染對照組(K562 c1)、野生組(K562 wt)和突變組(K562 mA)。采用LipofectamineTM2000轉染試劑將空載體MSCV-IRES-GFP(vector)和實驗質粒MSCV-Flag-NPM wt(Flag-NPM wt)、MSCV-Flag-NPM mA(Flag-NPM mA)連同 pEnvelope及pHelper輔助載體分別共轉染HEK293T 細胞。培養6 h后更換含有10% FBS 的DMEM培養基，于24、48 h收集上清液，經0.45 μm 濾器過濾收獲病毒液。將K562細胞接種于6孔板，加入制備好的病毒液，同時加入終濃度為8 mg/mL 的聚凝胺，擴大培養進行后續實驗。

1.3.3Western blot 收集細胞，用含100 mmol/L PMSF的細胞裂解液[10 mmol/L Tris鹽酸(pH 7.4),5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),150 mmol/L NaCl，1%曲拉通X-100(Triton X-100),250 mmol/L原釩酸鹽,20 mmol/L b-甘油磷酸]充分裂解提取細胞總蛋白。取60 μg蛋白用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，通過濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h后加一抗(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜，Tris鹽酸吐溫緩沖液(TBST) 洗滌10 min×2次，Tris鹽酸緩沖液(TBS)洗滌10 min，加二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h ，洗滌后用化學發光顯色試劑進行顯色。實驗設β-肌動蛋白(β-actin)為內參，結果采用Quantity One軟件進行分析。

1.3.4免疫共沉淀(Co-IP) 收集細胞，提取總蛋白，將細胞裂解液用E1A試劑[0.1% NP-40，50 mmol/L HEPES(pH 7.5),250 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA]定至1 mL體積，加入1 μg抗AKT的單克隆抗體，4 ℃緩慢旋轉孵育過夜。次日加入50 μL Ptotein A/G 磁珠(beads)，4 ℃緩慢旋轉孵育4 h，3 000 r/min離心2 min，將beads離心至管底后棄上清。用E1A試劑反復清洗beads，3 000 r/min離心2 min去除上清液，再用30 μL 2倍濃度的上樣緩沖液重懸，95 ℃煮沸5 min使蛋白復合物變性，13 000 r/min離心2 min取上清進行SDS-PAGE。

1.3.5免疫熒光 取轉染后的HEK293T細胞制備成1×106的單細胞懸液，取100 μL 接種于12孔板中的滅菌蓋玻片上，于5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后棄去培養液，用PBS輕輕洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次。0.1% Triton X-100透膜10 min，用10%山羊血清室溫封閉30 min，加封閉液稀釋的單克隆一抗(1∶100) 置4 ℃冰箱過夜。PBS洗3次，加入熒光標記的二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次后4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染色5 min，最后用甘油封片。熒光顯微鏡下觀察熒光信號的分布情況。

1.3.6CCK-8法檢測細胞增殖能力 收集轉染后的各組K562細胞，分別用低劑量AKT Ⅳ或者等劑量二甲基亞砜(DMSO)處理白血病細胞，制成細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，每組設3個復孔，5% CO2的37 ℃恒溫培養箱孵育，培養0、12、24、36、48、60、72 h每孔加入10 μL CCK-8(5 mg/mL)溶液，繼續培養1 h，在A450 nm波長處測量各孔的光密度(OD)值。以OD值為縱坐標，時間為橫坐標用SigmaPlot12.0軟件繪制生長曲線。

2 結 果

2.1K562細胞中NPM mA與AKT的相互關系 分別轉染vector、Flag-NPM wt、Flag-NPM mA于K562細胞中,采用Co-IP檢測NPM mA與AKT的結合作用。用抗AKT的單克隆抗體沉淀蛋白復合物后電泳轉膜，用Flag抗體進行免疫印跡分析。Western blot結果表明，K562 mA組在相對分子量32×103附近檢測到NPM mA蛋白，見圖1。上述結果提示K562細胞中NPM mA蛋白能與AKT結合。

Western blot檢測Co-IP蛋白復合物中的flag-NPM mA蛋白，WCE:全細胞裂解液

圖1外源性NPM、NPM mA與AKT的相互作用

2.2外源性NPM mA對AKT亞細胞定位的影響 在HEK293T細胞中分別轉染HA-AKT和Flag-NPM mA，熒光染色后觀察目標蛋白在細胞中的分布情況。結果顯示，轉染HA-AKT的293T細胞，細胞核和細胞漿可見很強的HA-AKT特異性熒光，轉染Flag-NPM mA的293T細胞在細胞核和細胞漿均可見熒光信號，而熒光信號主要集中于細胞胞質區域，見圖2A。此外，共同轉染Flag-NPM mA和HA-AKT到HEK293T細胞，發現帶紅色熒光的NPM mA主要分布于細胞胞質區域，而帶綠色熒光的AKT蛋白也在細胞的胞質區域累積，提示移位到胞質的NPM突變蛋白可能與AKT蛋白共同定位于胞質中，見圖2B。

A：HEK293T細胞中Flag-NPM mA和HA-AKT蛋白的亞細胞定位；B：共同轉染后Flag-NPM mA和AKT蛋白的亞細胞定位；HA-AKT、Flag-NPM mA呈紅色熒光，AKT呈綠色熒光，細胞核DAPI染色呈藍色熒光，MERGE為融合圖像

圖2外源性NPM mA與AKT的亞細胞定位(×400)

A： CCK-8法檢測轉染后各組K562細胞的體外增殖能力，Western blot圖為轉染后K562細胞中NPM和NPM mA的表達情況；a：P<0.01，與K562 c1組和K562 wt組比較；B：CCK-8法檢測AKT Ⅳ處理后各組K562細胞的體外增殖能力；b：P<0.01，與K562 c1+AKT Ⅳ組和K562 wt+AKT Ⅳ組比較

圖3過表達NPM mA聯合AKT Ⅳ對K562細胞體外增殖的影響

2.3外源性NPM mA與AKT對白血病細胞增殖的意義 圖3A中結果顯示，K562 mA組和K562 wt組與 K562 c1組相比NPM表達量上升，僅K562 mA組表達NPM mA。CCK-8法檢測轉染后K562細胞不同時間的生長曲線變化情況。結果顯示，72 h后K562 mA組相對于K562 c1組和K562 mA組細胞體外增殖能力明顯增強(P<0.01)，見圖3A。觀察AKT Ⅳ處理后各組細胞的體外增殖能力，結果發現，48 h后K562 wt組和K562 c1組體外增殖能力明顯被抑制，K562 mA組細胞仍能維持生長，差異有統計學意義意義(P<0.01)，見圖3B。

3 討 論

NPM基因突變對白血病細胞的惡性轉化具有重要調控作用[8]。NAKAGAWA等[9]提出，NPM C末端色氨酸對NPM的核仁定位起主要作用，突變的NPM C末端存在額外的NES核輸出序列，可導致NPM移位到細胞胞質。NPM突變并胞質移位后，ARF/p53的穩定性降低，癌蛋白c-myc活性增強從而導致細胞惡性增殖[10-11]。目前的機制研究多集中于NPM突變后對核仁蛋白活性的改變，聚積在胞質中的NPM對胞質蛋白的影響少有報道。AKT是調節造血的中央樞紐，可以通過多種途徑影響白血病細胞的增殖與凋亡。既往研究發現，OCI/AML3細胞中天然攜帶的NPM mA能夠與AKT相互結合，并可能參與調控細胞的增殖[12]。本研究進一步探討外源性的NPM mA與AKT的相互作用，觀察外源性NPM mA對AKT的亞細胞定位的影響，進一步檢測外源性NPM mA與AKT對白血病細胞增殖的意義。

采用Co-IP檢測NPM mA與AKT的結合作用，結果顯示，K562 mA組在相對分子質量32×103附近檢測到了NPM mA的蛋白條帶，說明NPM mA能與AKT結合。FALINI等[13]將突變的NPM轉染到NIH3T3細胞發現，突變的NPM蛋白主要聚集在胞質中。本研究熒光染色結果顯示，NPM mA主要集中分布于胞質，此結果與FALINI等[13]研究一致。而AKT彌散分布于細胞中，當共同轉染NPM mA和AKT到HEK293T細胞后，AKT的定位發生改變，由彌散分布轉移至細胞胞質。此結果說明，NPM發生突變后，突變的NPM蛋白可能攜帶AKT發生了轉移并最終改變了AKT的亞細胞定位。

為了觀察外源性NPM mA與AKT對白血病細胞生物學效應的影響，本研究選擇不攜帶NPM 突變基因的K562 細胞作為研究載體，通過慢病毒轉染使K562細胞表達 NPM mA 蛋白。CCK-8法檢測轉染后K562細胞的體外增殖能力，結果發現K562 mA組細胞相對于K562 c1組和K562 wt組細胞體外增殖能力明顯增強，此結果在本課題組以往的研究中亦有闡述[14]。AKT Ⅳ可抑制AKT的磷酸化激活。本研究中，采用低劑量AKT Ⅳ處理48 h后，K562 wt組和K562 c1組體外增殖能力被明顯抑制，K562 mA組細胞仍能維持生長，提示NPM mA能通過AKT調控K562細胞的體外惡性增殖。

綜上所述，本研究證實外源性的NPM mA能夠與AKT結合并改變AKT的亞細胞定位，且NPM mA能通過AKT調控K562細胞的體外惡性增殖。進一步研究將繼續探討胞質NPM mA對AKT活性的調控方式及對AKT下游信號分子的影響，而NPM mA對胞質中其他蛋白活性的影響亦是值得研究的方向。深入探討NPM突變蛋白在白血病發生、發展中的機制，將為闡明白血病的致病機制提供新的理論依據。

[1]FALINI B,BOLLI N,LISO A,et al.Altered nucleophosmin transport in acute myeloid leukaemia with mutated NPM1:molecular basis and clinical implications[J].Leukemia,2009,23(10):1731-1743.

[2]RAU R,BROWN P.Nucleophosmin(NPM1) mutations in adult and childhood acute myeloid leukaemia:towards definition of a new leukaemia entity[J].Hematol Oncol,2009,27(4):171-181.

[3]SCHNITTGER S,KERN W,TSCHULIK C,et al.Minimal residual disease levels assessed by NPM1 mutation-specific RQ-PCR provide important prognostic information in AML[J].Blood,2009,114(11):2220-2231.

[4]CHENG K,GRISENDI S,CLOHESSY J G,et al.The leukemia-associated cytoplasmic nucleophosmin mutant is an oncogene with paradoxical functions:Arf inactivation and induction of cellular senescence[J].Oncogene,2007,26(53):7391-7400.

[5]CILLONI D,MESSA F,ROSSO V,et al.Increase sensitivity to chemotherapeutical agents and cytoplasmatic interaction between NPM leukemic mutant and NF-kappaB in AML carrying NPM1 mutations[J].Leukemia,2008,22(6):1234-1240.

[6]LI Z L,BOONE D,HANN S R.Nucleophosmin interacts directly with c-Myc and controls c-Myc-induced hyperproliferation and transformation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(48):18794-18799.

[7]PANDURANGAN A K.Potential targets for prevention of colorectal cancer:a focus on PI3K/Akt/mTOR and Wnt pathways[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(4):2201-2205.

[8]BACHER U,BADBARAN A,FEHSE B,et al.Quantitative monitoring of NPM1 mutations provides a valid minimal residual disease parameter following allogeneic stem cell transplantation[J].Exp Hematol,2009,37(1):135-142.

[9]NAKAGAWA M,KAMEOKA Y,SUZUKI R.Nucleophosmin in acute myelogenous leukemia[J].N Engl J Med,2005,352(17):1819-1820.

[10]DEN B W,KUO M L,WILLIAMS R T,et al.Myeloid leukemia-associated nucleophosmin mutants perturb p53-dependent and Independent activities of the Arf tumor suppressor protein[J].Cell Cycle,2005,4(11):1593-1598.

[11]BONETTI P,DAVOLI T,SIRONI C,et al.Nucleophosmin and its AML-associated mutant regulate c-Myc turnover through Fbw7 gammol/La[J].J Cell Biol,2008,182(1):19-26.

[12]全靜，張帥帥，鮮敬榮，等．胞質NPM1突變蛋白與AKT的相互作用及其對急性髓系白血病細胞增殖的調控[J]．第三軍醫大學學報，2014，36(22)：2267-2271．

[13]FALINI B,BOLLI N,SHAN J,et al.Both carboxy-terminus NES motif and mutated tryptophan(s) are crucial for aberrant nuclear export of nucleophosmin leukemic mutants in NPMc+AML[J].Blood,2006,107(11):4514-4523.

[14]覃鳳嫻，邵會媛，張伶，等．過表達突變的NPM1 基因對THP-1 白血病細胞增殖和凋亡的影響[J]．基礎醫學與臨床，2012，32(3)：251-256．