抗氨甲酰蛋白抗體與類風濕性關節炎的相關性分析

陳燚瓊， 趙 迪， 任 方， 鄧曉剛， 徐 龍， 李 智

（同濟大學附屬楊浦醫院檢驗科，上海 200090）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，其特征是持續滑膜炎、全身性炎癥，血清中多可檢出自身抗體。RA的病因和發病機制目前仍知之甚少。及時診斷、及早治療對于RA的控制具有重要意義。迄今的研究已經證實，對RA特異性最高的自身抗體是針對含瓜氨酸表位蛋白的自身抗體，這些抗體被稱為抗瓜氨酸蛋白抗體（anti-citrullinated protein antibody，ACPA）。ACPA陽性和ACPA陰性的RA患者在遺傳基因、環境危險因素、疾病的進展和緩解等方面都有所不同[1-2]。過去幾年的研究主要聚焦于ACPA陽性RA患者的病因學、病情進展和治療等方面，而對ACPA陰性的RA患者研究較少。近年有報道稱在RA患者體內檢測出一種新的自身抗體系統——抗氨甲酰蛋白（carbamylated protein，Carp）抗體[3]。該抗體不僅能在ACPA陽性的RA患者血清中被檢測到，約有30%的ACPA陰性患者也能檢測到。本研究通過檢測RA患者血清中抗CarP抗體水平，初步探討抗CarP抗體在RA診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 RA組 選取2014年1月—2015年12月在同濟大學附屬楊浦醫院風濕科就診的門診及住院RA患者102例作為RA組，所有患者均符合2010年美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）制定的RA分類標準，其中男 34例、女68 例，年齡（61.2±12.2）歲。

1.1.2 非RA組 選取同期同濟大學附屬楊浦醫院風濕科除RA外的其他風濕性疾病患者55例作為非RA組，其中男13例、女42例，年齡（53.2±13.1）歲，包括系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE） 14例、原發性干燥綜合征（Sj?gren syndrome，SS）15例、強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）8例、骨性關節炎（osteoarthritis，OA）7例、痛風性關節炎2例、其他結締組織病9例。以上病例均符合相應的專業診斷標準。

1.1.3 健康對照組 選取同期同濟大學附屬楊浦醫院體檢健康者83名作為健康對照組，其中男32名、女51名，年齡（58.7±11.8）歲。

1.2 試劑與檢測方法

1.2.1 試劑 牛血清白蛋白V、氰酸鉀和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔抗人IgG、IgA均購自美國Sigma公司。

1.2.2 檢測方法 采集患者及健康對照組人群空腹靜脈血5 mL，離心后分裝血清，置于-80 ℃低溫冰箱中保存待測。采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）檢測抗Carp抗體，參照文獻[3]進行操作，用生理鹽水溶解牛血清白蛋白V，使其終濃度為4 mg/mL，加入1 mol/L氰酸鉀，37 ℃孵育12 h，用去離子水透析除鹽，以1 500×g離心15 min去除沉淀物，上清即為含高瓜氨酸殘基的牛血清白蛋白。用pH值9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋蛋白濃度至10 μg/mL，包被96孔微孔板，50 μL/孔，4 ℃放置過夜，用含0.05%Tween20的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌3次，用含1%牛血清白蛋白的PBS封閉微孔，100 μL/孔，充分洗滌后，拍干備用。待測血清標本用含0.05%Tween20和1%牛血清白蛋白的PBS作50倍稀釋，以50 μL/孔劑量加入已包被好的微孔板中，室溫孵育2 h，用上述洗滌緩沖液洗滌后，加入稀釋好的HRP標記的兔抗人IgG （50 μL/孔），室溫孵育2 h。充分洗滌并常規顯色，讀取各孔吸光度（A）值。每份標本均設復孔。將復孔A均值轉換為任意單位aU/mL，臨界值為健康對照的x ±2s。抗環瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體采用Cobas e601電化學發光分析儀（德國羅氏診斷有限公司）及配套試劑檢測，類風濕因子（rheumatoid factor，RF）、補體（complement，C）3、C4、IgG、IgA、IgM采用BNⅡ特定蛋白分析儀（德國西門子醫學診斷產品有限公司）及配套試劑檢測。

1.2.3 抗Carp抗體檢測方法的性能 抗Carp IgG抗體批內精密度低值為8.06%，高值為5.92%；批間精密度低值為7.52%，高值為5.34%；檢測范圍為1.27～15.08 U/L。抗Carp IgA抗體批內精密度低值為7.62%，高值為6.18%；批間精密度低值為7.02%，高值為5.91%；檢測范圍為1.00～13.32 U/L。抗Carp抗體的檢測結果不受黃疸（膽紅素＜302 μmol/L）、溶血（血紅蛋白＜4.76 g/L）和脂血（甘油三酯＜5.14 mmol/L）的影響。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析和兩兩比較的q檢驗，2個組比較采用t檢驗。非正態分布的計量資料以中位數（四分位數）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料用例數（率或構成比）表示，組間比較采用χ2檢驗，變量之間相關性分析采用Spearman相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RA組、非RA組、健康對照組血清抗Carp抗體水平及陽性率的比較

RA組血清抗Carp IgG抗體水平為（8.60±2.64） U/L，陽性率為42.16%，抗Carp IgA抗體水平為（6.65±3.09） U/L，陽性率為46.08%，均高于非RA組和健康對照組（P＜0.05）；非RA組抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體水平和陽性率亦高于健康對照組（P＜0.05），見表1、表2。將健康對照組抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體水平的x ±2s視為陽性閾值，計算出抗Carp IgG抗體對RA的診斷敏感性為42.16%，特異性為89.13%；抗Carp IgA抗體對RA的診斷敏感性為46.08%，特異性為86.96%。并根據此標準將RA組分為抗Carp抗體陽性組和抗Carp抗體陰性組。

2.2 抗CCP抗體陰性RA患者中血清抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體的陽性率

在RA患者中，抗CCP抗體和抗Carp IgG抗體均陰性者占7.84%，抗CCP抗體和抗Carp IgA抗體均陰性者占9.80%。在抗CCP抗體陰性的RA患者中抗Carp IgG抗體的陽性率為46.67%，抗Carp IgA抗體的陽性率為33.33%。

表1 RA組、非RA組、健康對照組血清抗Carp IgG抗體水平和陽性率比較

表2 RA組、非RA組、健康對照組血清抗Carp IgA抗體水平和陽性率比較

2.3 RA患者抗Carp抗體與相關實驗室指標的關系

2.3.1 抗Carp抗體水平與RA相關實驗室指標的關系 抗Carp IgG抗體陽性和陰性RA患者性別、年齡、C3、C4、RF和抗CCP抗體差異均無統計學意義（P＞0.05），而IgG、IgA和IgM差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。抗Carp IgA抗體陽性和陰性RA患者性別、年齡、C3、RF和抗CCP抗體差異均無統計學意義（P＞0.05），而IgG、IgA、IgM和C4差異均有統計學意義（P＜0.05），見表4。

2.3.2 抗Carp抗體與RA相關實驗室指標的相關性分析 RA患者抗Carp IgG抗體與年齡、病程、RF、抗CCP抗體、C3和C4無明顯相關性（P＞0.05），但與IgG、IgA和IgM呈正相關（r值分別為0.077、0.162和0.133，P＜0.05）；抗Carp IgA抗體與年齡、病程、RF、抗CCP抗體、IgM和C4無明顯相關性（P＞0.05），但與IgG和IgA呈正相關（r值分別為0.045、0.333，P＜0.05），與C3呈負相關（r=-0.049，P＜0.05）。

表3 血清抗Carp IgG抗體陽性組與陰性組RA患者實驗室指標的比較

表4 血清抗Carp IgA抗體陽性組與陰性組RA患者實驗室指標比較

3 討論

氨基甲酰化是一個非酶促的化學反應過程，在這個反應中，氰酸鹽介導賴氨酸轉變為高瓜氨酸。氰酸鹽是氨基甲酰化必需的物質，其在人體內天然存在且與尿素保持平衡[4]。在生理狀態下尿素的水平相當低，蛋白的氨基甲酰化也處于低水平。但特殊情況下，尤其是長半衰期的蛋白如基質分子易發生氨基甲酰化。腎功能衰竭時，由于尿素水平升高，蛋白的氨基甲酰化也同步增加[5]；吸煙作為RA最主要的環境危險因子，可能通過增加氰酸鹽的水平來提高氨基甲酰化水平[6]；慢性炎癥會發生廣泛的氨基甲酰化，因為中性粒細胞釋放過氧化物酶，該酶能將硫氰酸鹽轉化為氰酸鹽[6]。吸煙和慢性炎癥是RA重要的致病因素，由此提示蛋白的氨基甲酰化可能參與了RA的發病機制。

SHI等[3]發現有45%的RA患者抗Carp IgG抗體陽性，有43%的RA患者抗Carp IgA抗體陽性，而且重要的是約有16%的ACPA陰性RA患者可檢測到抗Carp IgG抗體，30%的ACPA陰性患者可檢測到抗Carp IgA抗體，抗Carp抗體與疾病的嚴重程度，主要是更高的關節損傷率有關。但有關抗Carp抗體與RA相關實驗室指標之間的關系尚未見報道，關于抗Carp抗體對RA診斷的特異性國外報道也很少，國內未見報道，而且國外研究對象主要為高加索人種。為此，本研究探討了抗Carp抗體在我國RA患者中的表達情況。

本研究結果顯示RA組血清抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體的水平和陽性率均高于非RA組和健康對照組（P＜0.05）。抗Carp IgG抗體對RA的診斷敏感性為42.16%，特異性為89.13%；抗Carp IgA抗體對RA的診斷敏感性為46.08%，特異性為86.96%。其診斷敏感性與SHI等[3]、SCINOCCA等[7]的研究結果基本一致，診斷特異性稍低于SCINOCCA等[7]的報道，可能與RA對照組中納入的病種和病例數不同有關，也可能與地域及研究對象的遺傳背景不同有關。本研究結果還表明抗CCP抗體陰性的RA患者抗Carp IgA抗體的陽性率為33.33%，與文獻報道[3-8]一致；抗Carp IgG抗體的陽性率為46.67%，高于SHI等[3]的報道。結果不一致的原因可能與RA組納入的病例病程不同有關。SHI等[3]的研究對象為病程＜2年的RA患者，隨訪1年，本研究對RA患者的病程未作嚴格的限制，有的病程長達30年。

本研究對抗Carp抗體與其他實驗室指標進行了分析，結果發現抗Carp IgG抗體陽性組IgG、IgA、IgM水平均明顯高于抗Carp IgG抗體陰性組，抗Carp IgA抗體陽性組IgG、IgA、IgM水平均明顯高于抗Carp IgA抗體陰性組，C4水平均明顯低于抗Carp IgA抗體陰性組；并且相關性分析也表明，抗Carp IgG抗體與IgG、IgA和IgM呈正相關，抗Carp IgA抗體與IgG和IgA呈正相關。這些結果提示抗Carp抗體可能與疾病的進展有關，其作為RA診斷和鑒別診斷及預后評估的血清學標志物的臨床意義值得進一步研究。同時抗Carp抗體是否與疾病的嚴重程度，即與患者的臨床指標如影像學表現、病情活動指數——RA疾病活動性評分系統等相關也值得關注。

綜上所述，RA患者血清中可以檢測到抗Carp抗體，對診斷RA有一定的敏感性和較高的特異性，尤其是在抗CCP抗體陰性的RA患者中也有一定的檢出率，這有助于抗CCP抗體陰性RA的診斷，提示其與抗CCP抗體、RF聯合檢測有助于提高RA的診斷率，且抗Carp抗體與疾病嚴重程度有一定的相關性，可作為臨床上診療RA的一個新的血清學指標。進一步研究抗Carp抗體的應用價值對于研究RA的發病機制及診療方法具有重要的意義。

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