廣州地區不同檢測系統精子濃度和精子活動力參考區間的建立及驗證

石漢振， 陳 西， 曾冬玉

（1.廣東省中醫院檢驗科，廣東 廣州 510120；2.中山大學北校區醫學檢驗系，廣東 廣州 510120；3.越秀區登峰社區衛生服務中心，廣東 廣州 510120）

男性精液質量是男性生育能力評價、優生優育的重要指標。目前，我國男性精液質量水平尚缺乏客觀的、大范圍的調查。國內外關于使用不同檢測系統或不同檢測方法進行精液參考區間調查的相關研究亦較少。黃春妍等[1]的研究結果顯示，1985—1995年間國內男性精液質量未見明顯變化，而1995—2008年14年間精子密度和精子總數明顯降低，可能與我國進入重化工時代引起環境污染有關。近30年來，多數研究認為生育期男性精液質量逐漸下降，但由于多數文獻不是大樣本隨機對照分析，因此該定論尚缺乏說服力[2]，也有少數研究認為精液質量下降證據尚不充分[3]。精液質量研究數據最早可追溯到1970年，已發表的大部分研究是回顧性的，對混雜因素和偏移難以控制，這可能是結果不一致的原因[4]。

2010年出版的《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）[5]［以下簡稱世界衛生組織（World Health Organization，WHO）手冊］中修訂的精子活力分級標準、精子形態學的嚴格標準和較低的正常參考值（4%）逐漸被國內多數男科實驗室采用[6]。但WHO手冊對精液常規參考區間的設定中并沒有涉及來自占世界人口1/5的中國人群的任何臨床數據和資料[7]。因此，盡管WHO手冊非常重要，但能否適用于中國人群仍需評估[8]。為此，本研究按不同地域人群及檢測系統建立精液常規分析主要指標（精子濃度、精子活動力）的參考區間，并驗證其是否適用于廣州地區的人群，以期為輔助生殖技術實施提供更準確、可靠的精液質量數據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2015年10月—2016年2月廣東省中醫院145名體檢健康男性的精液標本。

1.2 入選及排除標準

145份標本均來自2年內已生育過健康孩子的男性，排除生殖道或泌尿道慢性炎癥、遺傳性疾病、生殖道器質性疾病和有嚴重生活不良習慣者。由于精子質量存在地域性和種族間差異，環境因素如有毒物質、殺蟲劑、油漆等化學物質暴露可影響精液質量，體質指數和營養狀況對精液質量的影響也是不可忽視的，另外吸煙、飲酒、久坐工作等生活方式也可對男性生殖健康造成損害。因此，在選取參考個體時要考慮排除以上的影響因素。

1.3 儀器與試劑

SCA精子質量分析儀（西班牙Microptic公司）、Marker計數板、改良牛鮑計數板、恒溫水浴箱、光學顯微鏡、精子固定液、玻璃染缸、玻片、蓋玻片和10 mL塑料試管。

1.4 方法

1.4.1 收集標本 要求受試者禁欲2～7 d，取精室手淫取精，收集1次射精的全部精液于清潔、無毒密閉容器內，置37 ℃水浴箱中，待液化后進行精液分析。

1.4.2 計算機輔助精液分析系統（computer assisted sperm analysis，CASA）操作步驟 將1滴已液化的精液均勻涂抹在潔凈玻片上，在顯微鏡低倍鏡下作初步鏡檢。根據精子濃度估算稀釋倍數，用生理鹽水將精子濃度調整到（20～50）×106/mL，用加樣槍吸取10 μL精液加樣到專用計數板上；使用SCA精子質量分析儀檢測精子濃度、前向精子總數、總活動率、前向活動率。

1.4.3 Marker計數板操作步驟 將按適當比例稀釋后的精液吸取10 μL滴于Marker平盤中心區域，將蓋子蓋上，于20倍物鏡顯微鏡下找到視野后計數10個方格，計算精子濃度，并使用計數器分類計算精子活動力。

1.4.4 改良牛鮑計數板操作步驟 將計數板用擦鏡紙擦凈，在中央計數室上加蓋專用厚玻片。將稀釋后的精液用吸管吸取1滴置于蓋玻片邊緣，使精液緩緩滲入，室溫放置3 min，待精子全部沉降到計數室內后計數16個小方格內的精子數量。每份標本均計數3次，取平均值，按公式計算精子濃度。

1.5 統計學方法

1.5.1 建立參考區間 去除離群值采用Dixon 所提出的1/3規則。D值指一個極端觀測值（大的或小的值）和另一個極端觀測值（第二大或第二小的值）之間的絕對差值，而R值指所有觀測值全距，即最大極值和最小極值差值。如某個觀測值D值≥1/3 R值，就應剔除該極值。去除離群值后，隨機抽取不少于120例進行分析。采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，單側參考區間取95%可信區間[10]。

1.5.2 驗證參考區間 從健康體檢人群中另抽取20名健康個體（2年內已生育的男性）進行精液常規分析。如20名健康個體中只有不超過2名個體的檢測值超出原始參考區間（取95%可信區間），即通過驗證［11］。

1.6 質量控制

精液檢驗質量控制環節應規范受試者采樣前準備（包括禁欲時間）和精液采集方法、及時送檢、37 ℃溫浴避免精子自身破壞溶解、標本收集后及時處理[12]。分析過程中應注意加樣、稀釋的規范操作，盡量由同一實驗人員進行操作，以減少人為誤差，同一標本可做2次或多次平行試驗，以縮小隨機誤差。對使用的設備、儀器、試劑、加樣槍校準、質控應有標準操作規程。同一標本應選取不同視野重復計數，嚴格遵循WHO手冊上“對一定總數2個重復計數可接收差異”的要求，控制主觀因素引起的誤差[9]。此外，為保證避免儀器本身帶來的誤差，需依據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2文件對3種儀器進行正確度評價。收集5份標本（結果盡量分散于檢測范圍高、中、低點）分別用3種儀器進行精子濃度與活動力檢測。以牛鮑計數板為參考系統，比較Marker計數板和CASA的相對偏移，如果相對偏移＞15%，需查找原因，對Marker計數板和CASA進行校準。

2 結果

145名受試者檢測結果均呈正態分布，其中有8個離群值，按照要求予以剔除，剩余137個結果用于統計。

CASA、Marker計數板、改良牛鮑計數板檢測精子濃度的參考區間分別為≥27.60×106/mL、≥35.40×106/mL、≥31.00×106/mL。CASA、Marker計數板檢測精子總活動力的參考區間分別為≥40.90%、≥49.40%，前向活動力的參考區間分別為≥32.20%、≥35.00%。用于驗證的20名健康個體的精液常規檢測結果均在參考區間內。本研究建立的參考區間見表1。不同檢測系統精液常規分析單側生物參考區間低值及95%可信區間見表2。

表1 不同檢測系統精液常規分析結果

表2 不同檢測系統精液常規分析參考區間低值及95%可信區間

3 討論

參考區間是目前臨床實驗室最常用的解釋檢驗報告的一個“決策支持工具”[13]。臨床實驗室的檢測結果常與參考區間作比較，以判斷其有無臨床意義。不同地區健康人群的實驗室檢驗結果有顯著差異[14]。ICHIHARA等[15]進行的一項隨訪研究不僅證實了文獻[14]的研究結果，還指出了差異的生物學基礎。參考區間建立要注意以下問題：（1）生物屬性帶來參考區間的差異（主要是年齡、性別、民族、居住地域及妊娠等原因引起的差異）[16]；（2）對于同一項目的檢測方法可能有多種等[17]。因此，各實驗室有必要建立自己的參考區間。簡單地引用文獻或直接采用廠商給定的參考區間是不可取的。目前，建立適合我國人群檢驗項目的參考區間具有重要的臨床意義和社會價值。通過轉移驗證已建立的參考區間來確定自己實驗室的參考區間，可以避免不必要的重復檢測或臨床干預，有效提高臨床醫生評價患者精液質量及生育能力的診斷準確性，且同時為輔助生殖技術提供更準確的實驗室診斷。

精子濃度及活動力檢測有多種方法，但WHO手冊中只有手工方法（改良牛鮑計數板）的參考區間。隨著CASA在我國男科實驗室中的廣泛應用，使用計數池計數精子的男科實驗室越來越少。此外，Marker計數板也是常規用于精子濃度計數的工具之一[18-19]。因此，迫切需要建立這2種方法的參考區間。為此，結合地區人群差異，本研究建立了廣州地區3種檢測系統精液常規分析主要指標的參考區間。

將本研究建立的精液質量參考區間與WHO手冊比較，其中精子濃度及精子總數二者差異較大，主要是由本研究納入病例數不多、方法學差異、檢測技術誤差等原因引起。精子活動力差異較小，差異可能是由檢測技術誤差以及CASA將精液中其他雜質錯誤分類等原因引起。因此，在以后的研究中將通過增大納入病例數、減少檢測技術誤差等手段對精液質量參考區間進行修正。按WHO手冊要求，精液參考區間納入試驗者要求是其配偶在停止使用避孕措施后12個月內懷孕，但招募這類課題參與者困難很大，因此本研究將妊娠期限定為24個月內。此外，由于目前精液檢查儀器或方法缺乏權威性室間質評結果及性能評價方法，因此均可能造成實驗結果發生偏差。

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