臨床實驗室質譜檢測原理

張 巖， Thomas Jackson

（美國羅徹斯特醫學院病理和檢驗系，羅徹斯特 14642，美國）

臨床實驗室質譜（mass spectrometry, MS）技術在臨床實驗室中的應用隨著MS分析儀的創新不斷拓展。最早的MS分析儀采用扇形電場及磁場實現質量分離，體積大、價格貴。隨著四極桿MS分析儀與色譜分離、第1代氣相色譜（gas chromatography，GC）及液相色譜（liquid chromatography，LC）技術的聯用，大大提升了MS技術的實用性。三重四極桿等多重MS技術的聯用與LC分離技術令檢測向高敏、可重復、定量方向發展，這是目前臨床實驗室開展MS檢測的基礎[1]。隨著MS分析儀的不斷發展及軌道阱（Orbitrap）MS分析儀的誕生，LC-MS的聯用更是如虎添翼。

采用GC/MS對類固醇[2]及有機酸[3]進行檢測是MS技術最先在臨床實驗室應用的項目。繼串聯MS檢測酰基肉堿診斷新生兒遺傳代謝病（inborn error of metabolism，IEM）后，其在臨床檢測中的應用開始加速[4]。LC-MS聯用尤其是與串聯四極桿MS聯用時，能實現對小分子藥物及其代謝產物的量化檢測，促進了該領域儀器研發的進步[5]。治療藥物監測與毒理學的迅速發展在提升儀器靈敏度及實用性的同時，進一步擴大了MS技術的應用范圍[6]。

1 儀器

1.1 MS分析儀類型

MS分析儀可對單個分子或分子片段進行質量分析，要求被分析對象帶電荷并呈氣相，一般由緊密相連的離子源、質量分析器及檢測器3個部分組成。離子源外接樣品引入系統，是離子生成的部位；多數MS分析儀的質量分析器根據離子質荷比（mass-to-charge ratio，m/z）區分離子；檢測器將離子分別轉換成信號并傳入儀器數據處理系統，由數據處理系統控制整個儀器。

MS技術具有較高的特異性，尤其在與可重復色譜分離技術聯用時，其檢測結果可作為許多臨床檢測的“金標準”。也就是說，該技術可作為其他特定分子濃度檢測手段的校準方法。僅當某方法被作為參考方法且檢測嚴格按照書面程序進行時，可將液相色譜串聯質譜（liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）作為“金標準”。但由于MS分析儀系統復雜、維持其精密度以獲得準確的結果亦具有一定難度，MS技術常被視作“無其他方法可用時的最佳技術”。

MS分析儀根據m/z[離子質量（相對原子質量）÷ 電荷數]分析被測物的質量。例如，25-羥基維生素D3的相對原子質量為400，當加入1個質子[（400+1）個質子]而帶單電荷時，可在m/ z為401處被檢測到；當加入2個質子而帶雙電荷時[（400+2）個質子，402/2 = 201]，可在m/z為201處被檢測到。通常以m/z衡量準確度，檢測越準確則分子式鑒定能力越強。仍以25-羥基維生素D3為例，其分子式為C27H44O2，分子離子經質子化后的相對原子質量為401（加入1個質子形成C27H45O2），其精確質量保留至5位小數，為401.341 97。盡管經質子化的C27H45O2（25-羥基維生素D3，m/z為401.341 97）與C28H49O（菜油甾醇，m/z為401.370 52）之間的質量差異僅為0.028 55，但MS技術仍可通過m/z精確區分兩者。檢測誤差決定了質量檢測結果所對應的潛在分子式的數量。高分辨質譜儀（high resolution mass spectrometer，HRMS）能精確離子m/z。

整體準確性及有效位數層面的質量檢測能力是區分不同類型MS分析儀的標準之一。為提升整體準確性，MS分析儀常采用四極桿作為質量過濾器。四極桿由4根桿組成，以相對的2根桿為1組，通過在2組桿上施加相抵消的直流電高頻電壓來實現質量過濾。許多MS分析儀都可提供準確的質量信息，如檢測加速離子飛行時間的飛行時間（time of flight，TOF）MS分析儀[7-8]，檢測捕獲離子振蕩頻率的分析儀——利用磁場捕獲離子的傅里葉變換質譜分析儀（Fourier transform mass spectrometer，FTMS）與通過經典吸引平衡離子慣性進行捕獲的軌道阱MS分析儀[9-11]。

多重MS技術的聯用令MS分析儀能夠在離子水平上同時進行多項臨床實驗。由3個緊密聯系的四極桿分析儀組成的三重四極桿較為常用，其常見的工作模式見圖1[12]。最簡單的模式是全掃描，在質量分析器設定的掃描范圍內采集生成的全部離子的信號，Q1與Q3同時進行掃描，Q2設置為所有離子可通過、不含碰撞氣體，見圖1（a）；產物離子掃描可對不同質量的分子進行定量檢測，Q1設置為僅特定m/z的離子可通過，Q2中充入碰撞氣體令離子碎片化，Q3對片段產物進行掃描，見圖1（b）；母離子掃描可用于確定一類待測物中的所有母離子，識別共同碎片并觀察產生該碎片的所有母離子，由Q1進行掃描，在Q2中通過碰撞氣體使離子碎片化，Q3僅識別特定m/z的離子，該模式可檢測單個樣品中所有糖基化類型，見圖1（c）；與母離子掃描相近的是中性丟失掃描，該模式對Q1與Q3同時進行掃描，將兩者質量抵消偏移，Q2中充入碰撞氣體進行離子片段化處理，可通過觀察m/ z為18（相當于水）處的中性丟失情況來識別所有含羥基的離子，見圖1（d）；選擇反應監測（selected reaction monitoring，SRM）為一種三重四極桿分析儀常用的模式，可用于定量分析，Q1與Q3用于質量分析，Q2通過碰撞氣體進行碎片化反應，見圖1（e）。SRM進一步升級即為多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM），MRM以SRM為基礎，利用數據控制系統循序選擇多重反應類別。當MS分析儀連接色譜分離入口時，該模式尤顯重要。多重母子離子對即母離子與碎片離子的組合，可在特定時間內對色譜洗脫出的特定待測物進行監測。如采用化學性質與待測物相同的同位素標記標準品，則標準品與待測物的母子離子對同樣可通過MRM進行監測。各母子離子對的觀察時間短且與色譜層析圖譜峰寬相關，可準確測量峰面積并計算待測物濃度。SRM與MRM的特異性大幅提升了試驗信噪比，提高了靈敏度。

圖1 三重四級桿工作模式

串聯四極桿可與精密質量儀聯用，較常見的包括Qq-TOF、Qq-FTMS與Qq-Orbitrap[Q代表掃描四極桿，q代表碰撞（碎片）四極桿]。這類儀器可運行上述所有模式，其檢測結果更為準確。

1.2 離子化

MS分析均以離子為基礎，故待測物經MS分析儀檢測前需進行離子化，是MS檢測的基本操作。MS分析儀采用過各類離子源，不斷推陳出新，就像許多MS分析儀曾風靡一時但如今不再使用一樣。

目前，臨床實驗室MS檢測常用的是LC技術，LC-MS檢測最常涉及的電離方式有3種：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）、大氣壓化學電離（atmospheric-pressure chemical ionization，APCI）及大氣壓光電離（atmospheric-pressure photoionization，APPI）。（1）ESI最為常用，盡管工作機制尚未完全明確，但重要的是ESI過程始于對預制離子液的霧化[13]。液滴隨著溶劑分子的“揮發”而不斷收縮，直至庫侖爆炸令其碎片化。該過程持續至溶劑完全去除，留下帶電離子經過錐孔（大小需滿足維持分析過程中的真空需求）進入MS分析儀。同軸氣流可輔助霧化，附加氣流利于溶劑蒸發，兩者均可提高流速。電噴霧常產生多種帶電離子，增加電荷數量可提升MS分析儀的有效檢測范圍。（2）APCI采用LC流出物氣流輔助噴射技術，通過電暈針放電令溶液分子產生活性成分，使待測物分子質子化或去質子化，生成MS分析所需的帶電物質。（3）APPI同樣采用氣流輔助霧化，但通過紫外線光源對待測物直接電離，或對摻入噴霧的助劑分子進行電離從而使待測物離子化。盡管APPI僅適用于含芳香基團的特定類型待測物，但其信噪比極佳，故分析靈敏度非常高。這3類離子化技術均可與其他類型流體色譜法聯用。ESI與APCI常產生質子化分子離子，通過向待測物添加1個質子（H+）來觀察帶正電荷的離子，或通過分子離子去質子化（去除H+）來觀察帶負電荷的離子。APPI常通過丟失1個電子產生激發態陽離子。這3類離子化技術均屬于“軟”電離技術，主要產生準分子離子，通過檢測待測物中所有特定m/z的離子來提高其靈敏度。

GC是與MS分析儀最早進行聯用的色譜技術[14-15]，在臨床實驗室已有較豐富的應用經驗，但該技術如今已不及LC運用普遍。GC/MS采用電子轟擊（electron impact，EI）電離技術，優勢在于不同儀器所獲得的結果重復性較好，能提供大量信息，可外接數據庫能輔助鑒定化合物。與APCI相似，GC亦可向離子源中加入附加反應物，使其離子化并反應生成可與待測物進一步反應的物質，經質子化或去質子化形成帶正電荷的陽離子或帶負電荷的陰離子。這種離子化形式亦稱化學電離（chemical ionization，CI），可減少化合物碎片質量的差異，常用于測定未知物質的相對分子質量。

并非MS技術分析的所有樣品都需要進行色譜分析。基質輔助激光解吸離子化技術（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）常用于蛋白、多肽、寡核苷酸及細菌檢測[16]。將待測物與吸收紫外光（ultraviolet，UV）的基質溶劑混合，點樣于光滑金屬板上，干燥后放入MS源，一旦達到適宜的真空狀態，斑點受脈沖UV激光照射會令少量待測物自樣品中釋出，反應生成預形成離子或離子作為分析物進入MS分析儀。TOF MS電離呈脈沖性，常用于檢測。MALDI可用于MS成像研究。

另一類已成功運用于固體樣品電離的技術統稱為解吸電離[17]。該技術通過ESI或APCI電離溶劑后導向固體樣品。電離溶劑與固體反應后令待測物解吸并離子化，隨后導入MS分析儀。該技術已可用于干血斑（dried blood spot，DBS）[18]分析及MS成像。

MS分析儀聯合電感耦合等離子體（inductively coupled plasma，ICP）炬管可組成ICP-MS，能夠檢測金屬物質。該電離法采用高溫（～ 10 000 K）氬氣等離子體氣流分裂樣品并電離。儀器可直接檢測樣品中的金屬物質，有效開展重金屬中毒篩查[19]或聯合色譜分析明確待測物類別，提供有關金屬物質化學環境的信息[20]。目前臨床化學色譜分析中廣泛采用的電離技術見表1。

表1 臨床化學色譜分析常用電離技術的比較

1.3 樣品導入

正如MS檢測采用各類離子源一樣，樣品導入技術同樣也有許多種。其中一些基于分離輔助混合物分析，其他則側重于主體樣品，部分具有成像功能。

臨床化學最常用的2種色譜分析法為LC和GC，SFC、凝膠電泳、CE和凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）等較少被采用[21]。除凝膠電泳外，其他方法均可通過表1中的電離技術直接與MS分析儀串聯。SFC流動相多采用加壓二氧化碳，常用于手性分子分離[22]。CE同凝膠電泳一樣利用電場進行分離，但在狹小的毛細管中進行[23]。GPC亦稱尺寸排阻色譜（size-exclusion chromatography，SEC），常用于檢測較大生物分子，與傳統LC不兼容[24]。

LC技術正處在儀器根本性的變革中。2004年美國Waters公司推出了超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）。該高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）系統泵的最大工作壓力可達1 000 bar（15 000 psi），較以往提升了2倍，令柱化學新技術得以被采用，尤其對于較小粒徑的物質，反過來提高了色譜分辨率并減少了色譜運行時間。如上述，解吸技術可用于非成像檢測，也可用作二維或三維樣品成像。ICP可直接將樣品導入MS分析儀[25]，也可通過連接LC加以實現[19]。LC-ICP-MS技術可明確樣品中金屬物質的種屬。

1.4 待測物類型、來源及用戶群體

臨床MS檢測樣品的制備根據MS分析儀的分析類型、待測物、進樣系統及離子源而不同[26-30]。樣品類型與來源對樣品制備及預期的檢測結果影響極大。樣品制備最簡單的方式是“稀釋后直接進樣”，正如其字面意義，該法采用可溶溶劑對樣品簡單稀釋，常用于尿液檢測[31]；另一種稍復雜的樣品制備技術是蛋白沉淀，該法將溶劑加入血液樣品，令蛋白凝聚并沉淀，常通過離心加強這一過程，一般無法去除樣品中的基質或脂質干擾。液-液萃取是與既往技術相比具有一定優勢的經典樣品制備技術，但難以實現自動化。固相萃取技術使用固化吸附劑吸附待測物，可徹底清除樣品中的基質或脂質干擾[32]。固化吸附劑的親和力不同，需根據樣品及待測物類型進行選擇，未被吸附的干擾物經洗脫后，要采用強溶劑再次洗脫待測物。成功制備樣品的關鍵在于通過操作達到所需的樣品清潔度及充分的檢出限（limit of detection，LOD）即可，超出檢測所需的制備操作會增加時間與成本。常用LC-MS/MS樣品制備技術的比較見表2。

GC-MS分析要注意的是：待測物應能夠利用GC熱揮發進行分離。如待測物分子不揮發或受熱降解，則在保證樣品潔凈度的同時，還要進行衍生化處理令其揮發[33-34]。

MALDI及其他未涉及色譜層析分離的技術采用不同的樣品制備方式。定量MALDI與LCMS/MS相似，常采用同位素標記內標加入已知濃度樣品。在相同溶劑中溶解樣品與基質會帶來結晶、非必要沉淀等問題。微生物MS檢測要求樣品制備方式有較高的重復性，以便查閱。MALDI及其他成像技術則需維持樣品空間構型[35]。ICP-MS需要排除受外部環境污染的可能[36]，所以對樣品清潔度要求極高。

表2 常用LC-MS/MS樣品制備技術的比較

2 臨床實驗室開展MS檢測所面臨的挑戰

2.1 實驗室自建檢測項目（laboratory developed test，LDT）標準化的不足[37]

LDT指由臨床實驗室自行開發的檢測項目。許多臨床實驗室開展LDT檢測的方法相似，但仍缺乏標準化的基礎。盡管供應商正在著手開發囊括所有針對特定待測物檢測所需的試劑、柱以及包括分析軟件在內的“試劑盒”，但大部分臨床實驗室對流動相、校準措施、質控措施以其他檢測所需組件仍采用自行研發的方式。雖然在監管、標準化及室間比對等方面已做了一些努力，但不同臨床實驗室間的檢測結果仍存在差異。

2.2 缺少合適的內標

經同位素標記的“重”標準品已經十分普遍[38]，其與待測物化學性質完全相同，但特定元素被較重的同位素所代替，如2H、13C、15N與18O等。被替代的元素數目各異，但待測物分子質量的增加要求其可與標準品易于區分，所以有必要為每個待測物都設立特定標記內標，但在檢測多個待測物或仍缺乏標記物時，可考慮采用替代標準品。這種情況下，標準品的化學性質應盡可能與待測物接近，由于待測物洗出時存在干擾物質會減弱MS信號，采用同位素標記標準品可部分補償這類離子抑制效應[39]。

ESI最易受到離子抑制的影響，APCI與APPI則較少受離子抑制影響。如利用色譜分辨率自無活性的異構體表睪酮中分離出睪酮是較為困難的[40]，因為兩者質量相同且質量譜非常接近，準確定量要求一定的色譜分辨率。同樣，隨著對不同形式維生素D檢測需求的日益凸顯[41]，色譜分離需進一步努力提高分辨率。當被測物質量不同時可不采用色譜分離，色譜設備供應商已開始通過柱化學提高分辨率，但需對儀器進行更換，成本較高。

2.3 LC與GC分離所需的時間

為確保GC分析的熱穩定性，特別是需要進行衍生化處理時，會延長樣品制備的時間。

2.4 樣品制備過程無法實現自動化[42]

樣品制備需基于樣品類型、待測物、分析方法、已有設備、操作人員技術水平、各批次樣品數量、樣品制備與儀器（柱）污染間的成本/時間平衡，因此關于何為“最佳”樣品制備方法的意見尚未統一。血液、血漿與血清被視為最復雜的樣品基質，需要最煩瑣的制備處理，常需要多次蛋白沉淀與提取，而其他液體樣品制備則較簡單，可能僅需“稀釋后直接進樣”即可。穩定、易行的樣品制備方法是實現穩定可重復的定量分析的關鍵之一。自動化樣品制備雖然備受期待，其在高通量檢測中的前景最為開闊，但前期開發耗時長且設備耗材費用高昂。

2.5 實驗室信息系統的限制[43]

處理帶有批次樣品結果的電子數據表并進行手工輸入是數據處理的限速步驟，即便數據分析是自動化的，但仍需人工進行核對，包括對檢測適應癥、校準和質控數據的回顧以及人工核對臨床樣品峰值。

2.6 專業人員的短缺[44]

操作者是結果重復性及實驗室穩定運行的關鍵。目前，美國的許多臨床實驗室都存在專業人員短缺的問題。臨床化學MS實驗室對人員技術水平的要求高于自動化實驗室，需同時具備手工樣品制備、色譜及儀器日常維護能力。美國臨床化學學會（American Association for Clinical Chemistry，AACC）質譜與分離分委會（Mass Spectrometry and Separation Sciences Division，MS3）等組織正努力在這方面提供更多的培訓機會。

2.7 財務考量[45]

通常，MS分析儀及其相關設備的前期成本高昂，一旦方法建立后單個檢測成本較低，兩方面可相互平衡，但如果由實驗室承擔直接或間接培訓成本，則花費較大。另外，MS實驗室的技術人員尤其是LDT開發人員需接受大量培訓來掌握豐富的經驗、最先進的技術，這也需要大筆資金。

3 未來的儀器

MS技術不斷發展。隨著更多創新技術用于臨床檢測，相關儀器也不斷被研發出來。LC/LC等色譜層析領域的科研進展[46]在未來幾年將產生較大影響，樣品制備步驟的整合及自動化（如線上自動化樣品制備）同樣會影響深遠[47]。基于分子氣相形態的創新離子遷移分離開拓了新方向。未來某些標準化定量檢測儀器可能會集成納入臨床分析系統，而特定檢測的相應試劑盒也會出現[48-49]。總體而言，臨床MS檢測領域被遠大的目標所驅動著，包括：更靈敏、分辨率更高、更自動化、定量更準確、應用更廣泛、與實驗室信息系統整合更好。儀器系統的小型化與成本的降低令即時檢驗有望在醫生辦公室或診所開展，發展出供篩查使用的便攜式現場檢測設備[50]。

4 總結

MS技術的應用雖尚未普及，但將成為臨床實驗室的發展重點。三重四級桿將廣泛用于定量檢測，MALDI-TOF MS將用于成像及微生物鑒定。檢測目的、樣品及基質情況決定了MS分析儀類型及離子化方法的選擇。樣品制備是臨床MS檢測的關鍵，方法開發過程中要對樣品制備的速度、靈敏度及成本進行考慮及優化。

目前，MS檢測所面臨的挑戰源于多方面，挑戰同時也帶來機遇：采用新的色譜分離技術，發明新的分析方法，發現需要檢測的新分子，發布影響臨床MS技術應用的新規定等。儀器的速度不斷加快，靈敏度不斷提升，驅動著這一最激動人心的創新領域不斷發展。新一代儀器不斷涌現，色譜技術也進入復興中，其他類型MS技術的改進顯著提升了TOF及軌道阱MS分析儀在定量檢測中的適用性。

臨床MS檢測的潛力不可限量，但也充滿挑戰。希望這篇綜述能幫助讀者對MS設備及進樣系統的現狀有所了解，為臨床應用與決策提供指導。

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