氣相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中1 6種多環芳烴

于光明 崔宗巖 曹彥忠 李學民 賈光群 張進杰 王憲 高發明

（1 燕山大學環境與化學工程學院，秦皇島 066004；2 秦皇島出入境檢驗檢疫局，秦皇島 066004；3 秦皇島市衛生學校，秦皇島 066000）

蜂產品是營養全面的天然保健品，它不僅有調節機體生理機能，提高免疫力，增強體質等功能，還能作為中藥輔料治療和輔助治療多種頑疾，從而使人健康長壽。我國是世界第一養蜂大國，也是蜂蜜出口大國。然而，自加入WTO后，美國、日本和歐洲作為我國蜂產品的主要出口地區紛紛提出蜂產品中農藥、獸藥和化學污染物殘留限量標準，采取各種技術性貿易措施，致使我國蜂產品出口受到一定程度的限制[1]。

多環芳烴（PAHs）是指由兩個或兩個以上苯環以線狀、角狀或簇狀排列的化合物，廣泛分布于天然環境中，具有較強的致癌、致畸、致突變性。目前，大多數國家都將PAHs列為環境監測的重要內容之一[2]。蜂產品，包括蜂蜜和蜂花粉等，可以作為環境污染的指示標志物[3，4]，環境介質中的PAHs可以通過生物鏈或其他途徑遷移至蜂蜜中，產生一定的殘留和污染風險，因而需要建立蜂蜜中多環芳烴化合物的檢測方法，對其含量和污染水平進行監控。目前國內外關于測定大氣、土壤、水、食品等基質中PAHs的方法較為成熟，主要包括氣相色譜-質譜法[5-7]和液相色譜-熒光檢測法[8-10]等。國外研究表明，蜂蜜中含有一定量多環芳烴，以小分子非致癌多環芳烴為主[11]。國內測定蜂產品中PAHs殘留分析的文獻相對較少，其中PAHs的污染水平也缺乏相應的數據支撐。

本文采用固相萃取（SPE）結合氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)法，建立了蜂蜜中16種PAHs的分析方法，該方法具有操作簡便，靈敏度高，準確可靠的優點。

1 實驗部分

1.1 儀器和裝置

美國Thermo Fisher公司的TSQ 8000型氣相色譜-串聯質譜，配備有TRACE 1310氣相色譜儀，Agilent DB-1701色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；日本YAMATO公司SA300型振蕩器；美國Organomation公司的N-EVAPTM112型氮吹儀；日本島津公司生產的TXB622L電子天平；瑞士MettlerToledo公司的XP105分析天平；美國Millipore公司的Milo-Q高純水發生器；美國 Scientific Industries Vortex Genie 2多用途旋渦混合器。

1.2 試劑和材料

16種PAHs標準品（純度均≥96.0%，美國SUPELCO公司，詳見表1）；準確稱取各標準品適量，用甲苯稀釋成單標儲備液；準確吸取適量各標準儲備液于10 ml容量瓶中，用甲苯定容至刻度制成工作液混標，其中各PAHs濃度均為2.0 mg/l，置于冰箱4℃保存。16種PAHs同位素標準品（PAHs-D，純度均≥98.0%，美國ChemService公司），配制及保存同上，工作液中各PAHs-D濃度均為2.0 mg/l。

丙酮、正己烷、環己烷、乙酸乙酯、甲苯等試劑均為HPLC級，C18固相萃取柱（1 g/6 ml），均購自DIKMA公司；氯化鈉，分析純，天津市大茂化學試劑廠。彩色單道移液槍（2～20 μl，20～200 μl，100～1000 μl，德國Eppendorf有限公司）；津騰公司的0.45 μm濾膜；無水硫酸鈉，分析純，天津市大茂化學試劑廠（650℃干燥4 h后置于干燥器中備用）。所用其他試劑均為分析純及以上純度。所有玻璃容器在洗滌后用去離子水沖洗，再用超純水清洗后烘干備用。

1.3 樣品預處理

準確稱取5.0 g（精確到0.01 g）蜂蜜樣品于80 ml具塞玻璃離心管中，加入PAHs-D內標50 μl。加入50 ml去離子水溶解，渦旋混勻之后，震蕩30 min。混勻后上樣至C18固相萃取小柱上（預先用6 ml甲醇、6 ml去離子水活化），繼續加入20 ml去離子水淋洗，控制流速≤6 ml/min，之后將小柱抽干5 min，然后用10 ml二氯甲烷進行洗脫，洗脫液緩慢吹氮氣濃縮至近干，正己烷定容至1.0 ml后進GC-MS/MS檢測。

1.4 GC-MS/MS條件

氣相色譜條件：進樣口溫度290℃，載氣為高純He（純度＞99.999%），流速為1.5 ml/min；進樣量1 μl，不分流進樣；程序升溫：50℃保持1 min，以 30℃/min升溫至140℃，然后以10℃/min升溫至220℃，接著以5℃/min升溫至290℃，保持5 min。

質譜條件：E I源，溫度280℃；傳輸線溫度280℃；掃描方式為選擇離子反應監測模式（SRM）。16PAHs及內標的定量離子對、定性離子和碰撞能量等信息見表1。

圖1 16種PAHs總離子流圖

表1 16種化合物及對應同位素內標的串聯質譜實驗條件

2 結果與討論

2.1 串聯質譜條件優化

在選定的實驗條件下，首先通過全掃描方式（Full Scan，m/z 50-550）獲得16種多環芳烴的保留時間和一級質譜圖，從其中選擇豐度較高和質荷比較大的離子作為母離子；在不同碰撞能量下進行二級質譜掃描，從二級質譜圖中選擇子離子及對應碰撞能量，從而獲得特征離子對。

2.2 固相萃取條件優化

根據多環芳烴化合物的性質，選擇C18固相萃取柱小柱對蜂蜜樣品中目標物進行富集和凈化，并選用二氯甲烷為洗脫溶劑，對其用量進行考察。C18小柱活化后加入PAHs混合標準溶液50 μl，然后直接加入二氯甲烷進行洗脫，每2 ml收集洗脫液，緩慢濃縮至近干，正己烷定容至1 ml，分別進樣后繪制洗脫曲線見圖2。可見，使用8 ml二氯甲烷，即可將16PAHs完全洗脫下來，實際樣品洗脫溶劑用量適當放寬，選擇為10 ml。

進一步選取某空白洋槐蜜樣品，向其中添加濃度為20 μg/kg的PAHs混標，制成陽性樣品，并用其對體系pH值、改性劑用量和淋洗劑用量等實驗條件進行考察。

樣品溶于水后將其pH值分別調節為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，按照上述步驟進行SPE上樣、淋洗、洗脫、濃縮和檢測。結果表明，在測試范圍內蜂蜜樣品pH對實驗結果無明顯影響。由于大多數蜂蜜樣品 pH 值在 3.92～5.03 之間[12]，在考察范圍內，對PAHs檢測無影響，因而實驗選擇不進行pH調節。

圖2 代表性多環芳烴在C18固相萃取柱上的洗脫

表2 16種PAHs的線性范圍、線性回歸方程以及相關系數

表3 代表性蜂蜜樣品的16種PAHs的添加回收率和精密度

樣品溶于水后分別加入適量改性劑甲醇，含量分別為0、1%、2%、5%和10%，進行SPE處理和檢測。實驗結果表明甲醇小于5%時，對PAHs檢測無明顯影響，而當其含量增加至10%時，目標物回收率略微降低，因而實驗確定不加甲醇。

樣品溶于水后上樣進行SPE富集，然后分別加入不同含量的去離子水進行淋洗，加入量分別為0、5、10、20、30、50 ml，然后抽干、洗脫和檢測，結果表明，淋洗劑用量不超過30 ml時，目標物響應無明顯影響，但其含量達到50 ml時，目標物響應略有降低，因而實驗選擇淋洗劑用量為30 ml。

表4 實際蜂蜜樣品的16種多環芳烴檢測結果，μg/kg

2.3 方法評價

2.3.1 線性及檢出限

取適量PAHs工作液混標，加入內標50 μl，用正己烷稀釋配置成濃度為10、20、50、100、200、500的系列標準溶液（對應樣品濃度為2.0～100 μg/kg），以目標物與對應內標峰面積之比（Y）為縱坐標，以目標物濃度（X）為橫坐標，繪制工作曲線，得到16種PAHs的線性范圍、線性回歸方程以及相關系數（表2）。結果表明，16種PAHs的線性相關系數（r2）均不低于0.995，表明線性關系良好。以3倍信噪比(3S/N)對應濃度為方法檢出限，10倍信噪比(10S/N)對應濃度為方法定量限，得到該方法對16種多環芳烴的檢出限為0.6 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.3.2 回收率和精密度

選取棗花蜜、荊條花蜜、洋槐蜜、紫云英蜜和椴樹蜜為代表性樣品基質，在2.0 μg/kg，4.0 μg/kg和20 μg/kg三個添加水平下，按照上述流程進行處理和測定（n=3），得到回收率和精密度數據見表3。結果表明，16種PAHs平均回收率在63.4～122.1%之間，相對標準偏差均小于16%，能夠滿足日常檢測的要求。

2.3.3 實際樣品檢測

應用本文建立的方法對市售10批蜂蜜樣品進行檢測，樣品類型包括棗花蜜、洋槐蜜、油菜蜜、椴樹蜜、荊條蜜、紫云英蜜等，其中7個蜂蜜樣品有檢出，檢出PAHs以萘、苊、菲等小分子多環芳烴為主，具體數據見表4。說明本文方法適用于各類型蜂蜜樣品中多環芳烴化合物檢測。

3 結論

建立了蜂蜜中16種多環芳烴化合物檢測的固相萃取-氣相色譜-串聯質譜法。方法檢出限達到0.6 μg/kg，回收率和精密度良好，方法操作簡便，適用于各類型蜂蜜中多環芳烴化合物的測定。

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