姜黃素聯(lián)合PDTC體外抗白血病K562細胞的作用研究

高熒+于宜平+苗久旺

摘要：目的探討姜黃素聯(lián)合PDTC體外抗K562細胞的作用。方法MTT法檢測姜黃素單獨或聯(lián)用PDTC后對K562細胞增殖活性的影響；Hoechst33342染色法觀察細胞凋亡形態(tài)；Western blot法檢測Cleaved Caspase 3的表達活性。結果10 μmol·L-1姜黃素聯(lián)合25 μmol·L-1的PDTC后，可顯著提高對K562細胞增殖的抑制活性，并顯示出誘導細胞凋亡的形態(tài)學特征，使細胞Cleaved Caspase 3表達增加。結論姜黃素聯(lián)合PDTC可增強抗K562細胞作用，機制與誘導K562細胞凋亡作用有關。

關鍵詞：姜黃素；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽；細胞凋亡；Caspase 3

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2018）01-0072-03

【Abstract】Objective： To study the effect of curcumin combined with PDTC on anti- leukemia K562 cells in vitro. Methods： MTT assay was used to detect the effect of curcumin alone or in combination with PDTC on the proliferation of K562 cells. The morphology of apoptotic cells was observed by Hoechst33342 staining. The expression activity of Cleaved Caspase 3 was detected by Western blot. Results： After treated with 10 μmol·L-1 curcumin and 25 μmol·L-1 PDTC， the inhibitory activity on proliferation of K562 cells significantly increased， and the morphological characteristics of abduction apoptosis were also proved. The expression of Cleaved Caspase 3 increased. Conclusion： Curcumin combined with PDTC can enhance the anti-K562 cells and its mechanism is related to the abduction apoptosis of K562 cells.

【Key words】curcumin，pyrrolidine dithiocarbamate，apoptosis， Caspase 3

核因子-kappaB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）與腫瘤細胞的增殖、凋亡有密切關系[1]。研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）特異性抑制NF-κB后，對人白血病K562細胞的增殖有抑制作用、并可誘導凋亡，還可逆轉腫瘤耐藥[2]。姜黃素及其類似物抗K562細胞作用明確、且呈多靶點性，但存在不穩(wěn)定、易降解、體內吸收差、低濃度下抑制活性較弱的缺點[3，4]。采用高效低毒的中藥活性成分與腫瘤化療藥聯(lián)合應用以減少化療藥的用量、提高化療效果、降低藥物不良反應，是抗腫瘤藥物研究的重要方向。本文旨在采用低濃度的姜黃素聯(lián)合PDTC作用于白血病K562細胞，初步探討姜黃素聯(lián)合PDTC對抗K562細胞作用的影響，為治療慢性粒細胞白血病的藥物研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料人白血病K562細胞（中國科學院上海細胞庫）；姜黃素（sigma公司）；優(yōu)等胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone，Thermo公司）；MTT試劑盒（南京凱基生物公司）；Hoechst33342（sigma公司）；Cleaved Caspase 3（沈陽萬類生物科技有限公司）；PDTC、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、ECL增強型化學發(fā)光試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Actin、HRP（碧云天生物技術有限公司）。主要儀器有Multiscan MK 3-酶標儀（Thermo公司）、IX51-倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）、ImageQuant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)（GE公司）。

1.2細胞培養(yǎng)將K562細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液（含10% 胎牛血清）中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，長至對數(shù)生長期用于各實驗。

1.3MTT法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，調整細胞濃度為5×103個/mL。隔夜后，加入終濃度為0、1、5、10、30、50 μmol·L-1的姜黃素，及10 μmol·L-1的姜黃素與15、25 μmol·L-1PDTC單用或聯(lián)用，空白組加入等體積不含藥物及細胞的培養(yǎng)基，每組均設置三個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg·mL-1的 MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入100 μL SDS三聯(lián)液（10%SDS-5%異丁醇-0.012 mol·L-1 HCL），同時各組設置加藥但未加MTT對照孔，12h后，570 nm波長處檢測吸光度（A）值。按公式計算細胞抑制率：細胞抑制率=[（空白組A值-藥物組A值）/空白組A值]×100%[5]。

1.4Hoechst33342染色法觀察細胞凋亡形態(tài)取對數(shù)生長期細胞，采用不同濃度藥物處理后，加入Hoechst 33342（5 μg·mL-1）染色液30 μL，于37℃避光孵育20 min，PBS洗滌2次，調整細胞數(shù)后，取適量轉入96孔板，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。endprint

1.5Western blot方法檢測Cleaved Caspase 3的表達活性取對數(shù)生長期細胞，加藥后培養(yǎng)48 h，收集細胞，以PBS洗滌細胞2次，加入RIPA裂解液（含1 mmol·L-1的PMSF）冰上

裂解10 min。13000 r·min-1離心10 min，吸取上清，得到細胞總蛋白。用BCA法進行蛋白定量，取30 μg蛋白與上樣緩沖液混合，95℃變性5 min。12% SDS-PAGE凝膠中電泳，轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗后4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育50 min，TBST洗滌3次，每次10 min，加入ECL增強型化學發(fā)光試劑，置于凝膠成像系統(tǒng)成中成像[6]。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以形式表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計意義。

2結果

2.1姜黃素聯(lián)合PDTC可增強對K562細胞增殖的抑制作用K562細胞經不同濃度姜黃素作用后，劑量依賴性抑制細胞增殖。但姜黃素低于10 μmol·L-1時對K562細胞增殖的抑制活性均較弱（圖1）。采用10 μmol·L-1姜黃素與15、25 μmol·L-1的PDTC聯(lián)用后，可增強對K562細胞增值的抑制作用，其中10 μmol·L-1姜黃素與25 μmol·L-1的PDTC聯(lián)用比PDTC單用對K562細胞的抑制活性有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.2姜黃素聯(lián)合PDTC可增強誘導K562細胞凋亡作用不同濃度藥物作用于K562細胞48 h后，形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，空白組細胞核熒光均勻、形態(tài)基本完整；10 μmol·L-1姜黃素組有少量細胞核熒光增強，表現(xiàn)出較弱的凋亡特征；25 μmol·L-1 PDTC組部分細胞核表現(xiàn)出亮藍色熒光，細胞核濃縮，呈現(xiàn)出凋亡特征；聯(lián)合用藥組細胞核濃縮、破碎，并出現(xiàn)凋亡小體，凋亡現(xiàn)象明顯，提示姜黃素聯(lián)合PDTC可增強誘導K562細胞凋亡作用（圖2）。

2.3姜黃素聯(lián)合PDTC可增強誘導K562細胞的Caspases 3活化作用藥物作用于K562細胞48 h后，空白組及10 μmol·L-1姜黃素組誘導K562細胞Cleaved Caspase 3的表達較弱，與25 μmol·L-1PDTC聯(lián)合后作用增強，提示姜黃素聯(lián)合PDTC可增強誘導K562細胞凋亡蛋白Cleaved Caspase 3活性表達（圖3）。

3討論

慢性粒細胞白血病為惡性骨髓增殖性疾病，其發(fā)病率為1.6/10萬～2/10萬，占白血病發(fā)病總數(shù)的15%[7]。化學治療是慢性粒細胞白血病的治療方法之一，但化療藥物常存在不良反應大、耐藥等問題。NF-κB是細胞中重要的信號傳導因子，可通過基因調控發(fā)揮生物學功能，包括調節(jié)細胞的凋亡、參與免疫炎癥反應以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[8]。NF-κB被抑制后，可通過調控線粒體膜蛋白如bcl-2等，繼而激活Caspases誘導細胞凋亡。文獻研究表明，NF-κB抑制劑PDTC具有抗K562細胞作用、可逆轉化療藥對K562細胞耐藥，誘導細胞凋亡是其作用機制之一。

姜黃素是一種具有良好應用前景的天然多酚類物質，抗腫瘤作用廣泛，而誘導細胞凋亡是其重要機制。姜黃素可通過重塑多種分子靶點誘導細胞凋亡，包括上調死亡受體4/5、活化Caspase 3、促進細胞色素c的釋放、抑制Bcl-2蛋白及c-Myc表達等[9]。但穩(wěn)定性差、水溶性差且口服給藥生物利用度較低等缺點，限制姜黃素抗腫瘤藥效的發(fā)揮。將姜黃素與其他藥物聯(lián)合應用，作為惡性腫瘤治療的輔助用藥，用以增強化療藥的抗腫瘤效果、降低化療藥的毒副作用，是姜黃素臨床應用開發(fā)研究的一個重要研究方向。研究表明，姜黃素可通過下調Bcl-2表達、活化Caspase 3等機制誘導K562細胞凋亡[10]。姜黃素聯(lián)合黃連素作用于K562細胞，兩者聯(lián)用對細胞增殖的抑制具有協(xié)同作用[11]。姜黃素亦可與三氧化二砷或氯尼達明聯(lián)合，降低線粒體膜電位，釋放凋亡活性物質，激活線粒體凋亡途徑從而誘導K562細胞凋亡[12]。已有研究將PDTC與姜黃素聯(lián)用，PDTC可顯著增強姜黃素對腎癌ACHN細胞的放射增敏作用[13]。

本研究采用姜黃素和PDTC聯(lián)合用藥，聯(lián)合用藥組對K562細胞的增殖抑制作用優(yōu)于姜黃素組和PDTC組，且10 μmol·L-1姜黃素與25 μmol·L-1的PDTC聯(lián)合后作用比較明顯，有顯著性差異，提示姜黃素聯(lián)合PDTC可增強抗K562細胞作用效果，從誘導細胞凋亡的形態(tài)學及凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3的表達方面證實兩者協(xié)同誘導K562細胞凋亡為其增效機制。

參考文獻：

[1]黃培林，朱世能，陸世倫.NF-κB、IκB與腫瘤細胞凋亡[J].實用癌癥雜志，2001，16（1）：103-104+107.

[2]楊婷婷，薛天陽，許偉.NF-κB抑制劑PDTC逆轉K562/AO_2細胞耐藥性及其機制的研究[J].中國實驗血液學雜志，2010，18（4）：903-908.

[3]苗久旺，張欽德，王洪波，等.雙去甲氧基姜黃素通過降低線粒體膜電位誘導人白血病K562細胞凋亡[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（24）：109-113.

[4]Hatcher H，Planalp R，Cho J，et al.Curcumin：from ancient medicine to current clinical trials[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2008，65（11）：1-22.

[5]苗久旺，張忠泉，張亞宏，等.新型氮芥衍生物XHH誘導K562細胞凋亡的研究[J].華西藥學雜志，2012，27（01）：005-008.endprint

[6]Li YB，Gao JL，Zhong ZF，et al.Bisdemethoxycurcumin suppresses MCF-7 cells proliferation by inducing ROS accumulation and modulating senescence-related pathways[J].Pharmacological Reports，2013，65（3）：700-709.

[7]中華醫(yī)學會血液學分會.中國慢性髓性白血病診斷與治療指南（2016年版）[J].中華血液學雜志，2016，37（8）：633-639.

[8]Karin M.Nuclear factor-κB in cancer development and progression[J].Nature，2006，441（7092）：431-436.

[9]Roxas M.Curcumin as “Curecumin”：from kitchen to clinic[J].Biochemical Pharmacology，2008，75（4）：787-809.

[10]Jia YL，Li J，Qin ZH，et al.Autophagic and apoptotic mechanisms of curcumin-induced death in K562 cells[J].Journal of Asian Natural Products Research，2009，11（11）：918-928.

[11]Balakrishna A，Kumar M H.Evaluation of synergetic anticancer activity of berberine and curcumin on different models of A549，Hep-G2，MCF-7，Jurkat，and K562 cell lines[J].BioMed Research International 2015，2015（4）：1-7.

[12]Sánchez Y，Simón G P，Calvio E，et al.Curcumin stimulates reactive oxygen species production and potentiates apoptosis induction by the antitumor drugs arsenic trioxide and lonidamine in human myeloid leukemia cell lines[J].Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics，2010，335（1）：114-123.

[13]Li G，Wang Z，Chong T，et al.Curcumin enhances the radiosensitivity of renal cancer cells by suppressing NF-κB signaling pathway[J].Biomedicine & pharmacotherapy，2017，94：974-981.

（收稿日期：2017-10-27）endprint