清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠Bax蛋白及Bcl-2蛋白表達的影響

金 雙 高連印 趙夢培 車念聰 張秋云 杜宇瓊

(首都醫科大學中醫藥學院中醫臨床基礎學系 中醫絡病研究北京市重點實驗室， 北京 100069)

慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis，CSH)是以肝細胞的廣泛變性、壞死，出現肝衰竭為主要特征的嚴重肝臟疾病[1]。研究[2]表明，CSH常伴隨腸道通透性增高，導致內毒素大量入血，內毒素在加重肝損傷同時激活肝細胞線粒體凋亡途徑誘導肝細胞凋亡。因此，在治療上，除了挽救和修復嚴重損害的肝細胞，促進患者的肝細胞再生之外，抑制肝細胞的凋亡也是治療CSH的重要環節[3]。清毒湯是王融冰教授治療重癥肝炎的經驗方，具有清熱解毒、滋陰通下的功能，能夠改善CSH患者的癥狀和體征。前期研究[4-6]表明清毒湯臨床治療慢性重型肝炎安全有效，對模型大鼠有保肝、降低腸道通透性、抑制NF-κB活性的作用。本課題使用硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)灌胃建立重癥肝損傷大鼠模型，運用Western blotting等技術分析肝細胞線粒體凋亡途徑中關鍵分子Bcl-2、Bax蛋白的表達，用TUNEL法檢測肝細胞凋亡指數(apoptotic index，AI)探討清毒湯降低內毒素產生、抑制肝細胞線粒體凋亡通路減輕慢性重型肝炎的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠72只，雌雄各36只，體質量190～210 g，實驗動物許可證號: SCXK(京) 2012-0001。北京維通利華實驗技術有限公司提供，飼養于首都醫科大學基礎科研樓動物實驗中心SPF級動物房，分籠飼養，溫度(22.0±1.0)℃，相對濕度(50.2±1.0)%，自由進食飲水。每隔12 h開燈照明。所有實驗操作均經首都醫科大學倫理委員會審核批準(批準文號：AEEI-2016-137)。

1.2 實驗試劑

清毒湯藥物組成: 大黃10 g、枳實10 g、厚樸10 g、玄參10 g、茜草9 g、生地黃12 g，上述藥物均購自北京中醫醫院，由首都醫科大學煎藥室煎制，煎煮濃縮成生藥質量濃度為1.6 g /mL 的水煎劑，分裝，4℃冰箱保存備用，灌胃前水浴加熱，搖勻。

TUNEL試劑盒(貨號：11684817910，瑞士Roche公司)；DAB顯色劑(貨號：K5007，丹麥DAKO公司)；硫代乙酰胺(貨號：S0646，北京科奧科技有限公司)；乳果糖(貨號：ka0009454，北京科奧科技有限公司)；Bax抗體(貨號：2772S，美國Cell Signaling Technology公司) ； Bcl-2 抗體(貨號：SC-509，美國Santa Cruz公司) ；β-actin(貨號：4967，美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3 造模及給藥

72只大鼠適應性喂養7 d后，采用Excel隨機數字表隨機分為正常組12只，造模組60只。本實驗采用TAA誘導大鼠重度肝損傷模型[4]。前8周造模組予以TAA 12 mg· kg-1·d-1進行灌胃，正常組予以等量的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液灌胃。并在第8周末采用數字表法將所有造模組隨機分為模型組乳果糖治療組、清毒湯治療組(小劑量、中劑量、大劑量組)，每組12只。第9～12周，所有造模組大鼠將TAA的量增加至36 mg· kg-1·d-1，同時，乳果糖組則給予3.5 mL· kg-1·d-1的乳果糖；清毒湯小、中、大劑量組給予清毒湯生藥制劑量分別為5.08、10.17、20.33 g· kg-1·d-1。正常組仍給予等量的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液。造模及治療期間，所有動物在實驗條件下自然飲食，在造模第12周末夜間禁食。

1.4 標本制備

造模過程中大鼠死亡15只，剩余大鼠57只。上述所有剩余大鼠在第12周末禁食10～12 h后，采用10%(質量分數)的水合氯醛進行腹腔注射麻醉，給藥量為0.35 mL/100 g。開腹，腹主動脈無菌取血，緩慢注射于無菌真空采血管內，3 000 r/min，4℃，離心15 min，取其上清液分裝，置于-80℃冰箱保存備用。取剩余肝組織在冰板上快速剪碎后分裝于凍存管內，用液氮進行速凍，隨后將組織移至-80℃冰箱存放。

1.5 指標檢測

1.5.1 原位細胞凋亡檢測(TUNEL法)

肝組織用10%(體積分數)甲醛溶液固定后進行石蠟包埋、切片，常規脫蠟、水化，按照TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進行操作。DAB顯色，蘇木素復染。6組各隨機選5個高倍鏡視野進行觀察，每個視野計數100個肝細胞核。細胞凋亡指數(apoptotic index，AI)=凋亡細胞數/總細胞數×100%，最后計算凋亡細胞百分比的均數。

1.5.2 Western blotting法檢測肝組織中Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量

取適量肝組織冰上融化，細胞裂解液處理，離心后取上清，通過電泳將蛋白分開并轉至硝酸纖維膜上，用含5%(質量分數)脫脂奶粉的TBST封閉1 h，Bax一抗(1∶1 000)、Bcl-2一抗(1∶200)37℃溫育過夜，用TBST洗滌3次，每次10 min，二抗(1∶10 000)，37℃溫育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，滴加熒光底物發光顯色。用Image Pro Plus進行灰度統計。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 肝組織TUNEL檢測

本實驗中凋亡細胞為棕黃色的圓形或卵圓形致密板塊(圖1箭頭所示)。正常組基本未見細胞凋亡(圖1A)；模型組可見大量深褐色凋亡細胞(圖1B)；與模型組比較，乳果糖組和清毒湯各組凋亡細胞各有不同程度減少(圖1C～F)，其中中劑量和大劑量凋亡細胞減少更明顯，詳見表1。

TUNEL法檢測細胞凋亡率要求樣本量≥3只即可，此處根據大鼠各組剩余情況選擇樣本量為5只。

圖1 肝組織TUNEL檢測結果Fig.1 TUNEL detection of apoptotic rate in rat liver cell(400×)

A：normal control group;B:model group;C: lactulose group;D: small dosage group of Qingdu decoction;E: medium dosage group of Qingdu decoction;F: large dosage group of Qingdu decoction；Arrowshowed an apoptotic live cell；TUNEL：terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling.

表1 各組大鼠肝細胞凋亡指數比較Tab.1 Comparison of apoptotic index ofrat liver cells in each group ()

*P<0.05，* *P<0.01vsnormal control group；△△P<0.01vsmodel group；▲▲P<0.01vslactulose group;QDTS: small dosage group of Qingdu decoction;QDTM: medium dosage group of Qingdu decoction;QDTL: large dosage group of Qingdu decoction;AI: apoptotic index,n=5 for each group.

2.2 清毒湯對肝細胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠Bax蛋白相對表達水平升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白、Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；與模型組比較，所有治療組(乳果糖組和清毒湯各組)Bcl-2蛋白表達量、Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05或P<0.01)，Bax蛋白相對表達水平下降(P<0.01)，其中清毒湯中劑量組和大劑量組表現最明顯，但是中、大劑量之間差異無統計學意義；與乳果糖組比較，清毒湯中劑量和大劑量Bcl-2蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax比值增高(P<0.01)，Bax蛋白相對表達量減低(P<0.01)，但清毒湯中、大劑量組之間差異無統計學意義(圖2、表2)。

Western blotting法在外文文獻中要求樣本量≥3只，而在中文文獻中要求滿足每組≥5只即可，所以此處每組選擇 5 只。

圖2 各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達Fig.2 Protein expressions of Bax，Bcl-2 inrats in each group

A：normal control group;B:model group;C: lactulose group;D: small dosage group of Qingdu decoction;E: medium dosage group of Qingdu decoction;F: large dosage group of Qingdu decoction.

表2 各組大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白的表達水平比較Tab.2 Comparision of protein expressions of Bax，Bcl-2 in rats in each group()

3 討論

中醫古籍中 “瘟黃”、 “急黃”、“肝瘟”等疾病的描述符合現代CSH的臨床表現[7]。目前中醫對該病的認識：本虛標實，因虛致實，“毒、瘀、虛”是關鍵具有普遍性[8]；首都國醫名師王融冰教授亦提出CSH病位在肝絡，病機乃因虛致實，虛者肝體俱虛，多臟虛損，實者乃毒瘀膠著，邪氣雍滯[5]，受李梃“肝與大腸相通”理論啟示，提出了“通腸治肝”治療CSH的新思路，并創制了治療本病新的中藥方劑清毒湯。前期研究[4-6]證實清毒湯治療TAA致重癥肝損傷大鼠療效顯著。本次實驗顯示，清毒湯能夠明顯降低CSH大鼠病死率，提高大鼠的生存質量，與之前的結果一致。從TUNEL染色顯示的結果看，清毒湯能夠明顯改善CSH大鼠肝細胞凋亡情況，從而達到保護肝功能的作用。

目前在已知的細胞凋亡的途徑中，線粒體途徑被公認為是細胞凋亡的中心環節[9-12]。而由 NF-κB 介導的 Bcl-2 家族蛋白被認為是線粒體凋亡途徑中的主要調控蛋白[13]。Bcl-2蛋白和Bax蛋白都是Bcl-2 家族蛋白的重要組成部分，Bcl-2蛋白主要附著在線粒體膜上，當其與線粒體膜上的離子通道結合時可以調節Cyt-c的釋放。另外，研究[14-15]顯示Bcl-2能夠降低線粒體復合物的活性，使線粒體內Cyt-c的含量減少，同時能夠與凋亡肽酶激活因子結合，阻止線粒體內Cyt-c釋放到胞質中，并且阻止Caspase被胞質中Cyt-c激活，阻斷凋亡的發生。Bax 則能夠促進線粒體內Cyt-c釋放，具有拮抗 Bcl-2 蛋白抑制細胞凋亡的作用，最終促進細胞的凋亡。Bcl-2 的抗凋亡效應及 Bax 的促凋亡效應已得到普遍認可，而Bcl-2、Bax 的比值對細胞凋亡機制也有重要影響，提高 Bcl-2/Bax 的比值，可抑制細胞凋亡，而降低 Bcl-2/Bax 的比值，則會促進細胞凋亡。

本實驗結果顯示，模型組肝組織Bax蛋白表達量較正常組顯著升高，Bcl-2蛋白表達量較正常組顯著降低，而各治療組(乳果糖組、清毒湯大、中、小劑量組)Bax蛋白及Bcl-2蛋白水平較模型組分別有不同程度降低和升高，其中清毒湯中劑量組表現最明顯。

同時，各治療組大鼠肝組織TUNEL的病理檢測結果提示清毒湯中、大劑量組較模型組肝細胞凋亡數量顯著減少，但清毒湯中、大劑量組間差異無統計學意義。故推測清毒湯方可能通過調控Bcl-2、Bax蛋白的表達來減輕肝細胞的凋亡，從而改善肝臟病理結構，達到保護肝臟的作用，這些結果為本方臨床治療CSH疾病提供了依據。

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