響應面法優化杜仲葉中綠原酸提取工藝

鄧愛華 ，李紅勇 ，謝 鵬 ，王 云 ，彭才旺 ，程麗楠

（1.湖南文理學院 生命與環境科學學院，湖南 常德 415000；2.湖南人文科技學院 農業與生物技術學院，湖南 婁底 417000）

杜仲Eucommia ulmoides Oliv為杜仲科落葉喬木，是我國特有經濟植物，主要分布于湘、桂、川、滇及長江中下游流域等[1-2]。據《本草綱目》記載，杜仲皮為名貴滋補藥材，而杜仲樹剝皮后容易死亡，制約了杜仲的藥用價值推廣[3]。現代研究發現，杜仲葉與杜仲皮具有相同的功能成分和藥理功效，杜仲葉中活性成分綠原酸含量高達5%，且富含京尼平苷、桃葉珊瑚苷等[4-5]。綠原酸具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、保護心血管和清除體內自由基等作用[6-7]，對治療血液、消化及生殖系統等方面的疾病有顯著效果[8]。因此，杜仲中綠原酸的提取開發成為研究者關注的熱點[9-11]。

綠原酸屬于極性有機酸，一般采用極性較強的水提取杜仲葉中綠原酸[12-13]。然而，綠原酸在強極性溶劑和高溫下容易發生水解和分子內酯基遷移現象[14]，從而異構化形成新綠原酸和隱綠原酸，導致新綠原酸和隱綠原酸含量升高，綠原酸含量下降。為了強化提取效率和縮短提取時間，研究人員采用微波輔助提取法[15]、超聲波輔助提取法[16]和生物酶法[17]等進行提取，這些方法在一定程度上改善了提取效果，但由于設備投資大，運行成本高，不適合工業化生產。除此之外，采用水提取法所提取綠原酸的雜質較多，加大了后續分離的成本。為此，有人嘗試用極性適中的有機溶劑提取法，有機溶劑能夠抑制植物酶對綠原酸的催化分解作用，減少水溶性雜質的溶出[18]。同時還發現，綠原酸在乙醇體系中比在甲醇、丙酮等有機體系中更加穩定，乙醇成為提取綠原酸的首選溶劑[19]。傳統的單因素和正交設計試驗誤差較大，已不能滿足杜仲葉的綠原酸提取工藝優化要求[20-21]，基于數學與統計學結合的響應面分析法不僅能夠縮短優化時間，而且建模速度快，工程應用的可信度高[22]。為此，本文中以乙醇水溶液作為提取溶劑，在單因素試驗基礎上，通過響應面法分析乙醇濃度、料液比、提取溫度等工藝參數對杜仲葉中綠原酸提取率的影響，旨在為優化杜仲葉綠原酸的提取工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

杜仲葉（湖南廣源生物科技有限公司），綠原酸標準品（北京盛世康普化工技術研究院），其他試劑為分析純（國藥集團）。

1.1.2 主要儀器設備

UV-5100型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司），BT25S型電子天平（賽多利斯有限公司），101-2AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），FW135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），TDL-40B型高速離心機（上海安寧科學儀器廠），HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒儀器有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 標準曲線的制備

參考相關文獻[23]，精密稱取10.4 mg的綠原酸標準品，用40%乙醇溶液定容至10 mL，配制1.04 mg/mL的母液，再將母液分別稀釋成5.2、10.4、15.6、20.8、31.2、41.6 μg/mL 的標準溶液。測定各標準溶液在325、345 nm的A325、A345值，求得ΔA。以吸光度ΔA為橫坐標，綠原酸濃度C為縱坐標，繪制標準曲線，C＝47.281 0ΔA－0.510 5，R2＝0.999 3，說明標準曲線線型相關性良好。

1.2.2 樣品檢測

將杜仲葉在鼓風干燥機中烘干后粉碎，過篩，稱取粉碎后的樣品20.0 g置于500 mL燒杯中，加入280 mL 40%的乙醇水溶液，放于60 ℃恒溫水浴鍋中回流提取30 min后，濾液真空抽濾，然后將提取液5 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋50倍。以40%乙醇溶液為參比，用紫外分光光度計測定A325、A345值，求出提取液中的綠原酸含量。

1.2.3 穩定性測定

將待測樣品置于室溫下24 h，再進行吸光度測定，結果見表1。由表1可知，各樣品在40%乙醇溶液中的吸光度值變化不大，說明各樣品在40%乙醇溶液中表現穩定。

表1 樣品放置24 h后吸光度變化Table1 Changes of absorbances of placed samples after 24 h

1.2.4 單因素試驗設計

稱取20.0 g杜仲葉粉末加入500 mL三頸燒瓶中，然后加入一定濃度的乙醇水溶液，加熱至設定溫度，回流提取一定的時間后，按照1.2.2方法檢測提取液中綠原酸含量，分別考察乙醇質量分數（10%、20%、40%、60%、80%、100%）、 溫度（30、50、60、70、80、90 ℃）、時間（30、45、60、75、90、105 min）、料液比（1∶ 6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16）以及提取次數等因素對綠原酸提取率的影響。

1.2.5 響應面法優化設計

在單因素實驗基礎上，確定料液比、乙醇質量分數、提取溫度3個因素及水平值，運用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken響應面設計和數據分析。料液比、乙醇質量分數、溫度分別以A、B、C表示，每個因素的高中低水平分別以1、0、-1進行編碼，各試驗因素及水平值見表2。

表2 試驗因素及水平Table2 Factors and levels of experiment

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇質量分數對綠原酸提取率的影響

在料液比1∶14、提取溫度60 ℃、提取時間30 min條件下，考察不同乙醇質量分數對綠原酸提取率的影響，結果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著乙醇質量分數的增高，綠原酸的提取率呈先上升后下降的趨勢，選擇40%乙醇作為提取溶液質量分數。

圖1 乙醇質量分數對綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.2 提取溫度對綠原酸提取率的影響

在料液比1∶14、乙醇質量分數40%、提取時間30 min條件下，考察提取溫度對綠原酸提取率的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，在30～60 ℃之間，綠原酸提取率隨著溫度的升高而增加，達到60 ℃后，隨著溫度的進一步升高，綠原酸的提取率呈緩慢下降趨勢。綠原酸為熱敏性物質，在高溫下容易失去活性，所以適宜的提取溫度為60 ℃。

2.1.3 提取時間對綠原酸提取率的影響

在料液比1∶14、乙醇質量分數40%、提取溫度60 ℃條件下，考察提取時間對綠原酸提取率的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，綠原酸的提取率隨著提取時間的增加而迅速增長，60 min時提取率最高，之后隨著提取時間的增加提取率迅速降低，可能是隨著提取時間的延長，部分綠原酸在高溫下分解。因此，選擇提取時間60 min。

圖2 提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

圖3 提取時間對綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.4 料液比對綠原酸提取率的影響

在乙醇質量分數40%、提取時間60 min、提取溫度60 ℃條件下，考察料液比對綠原酸提取率的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，綠原酸的提取率隨著料液比的增加而不斷上升，當料液比為1∶14時提取率最大，隨后趨于平穩。

2.1.5 提取次數對綠原酸提取率的影響

圖4 料液比對綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of chlorogenic acid

取杜仲葉粉20.0 g，在乙醇質量分數為40%、溫度為60 ℃、料液比為1∶14的條件下提取60 min，并提取4次，如圖5所示，綠原酸的提取率在2次提取后趨于穩定，所以選擇2次作為提取次數。

圖5 提取次數對綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of chlorogenic acid

2.2 響應面法試驗

2.2.1 響應值結果及其擬合模型

采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，固定液料比1∶14，提取次數2次，分析乙醇質量分數、提取溫度和提取時間對綠原酸提取率的影響。試驗設計及結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計及結果Table3 Design and results of the response surface experiment

2.2.2 模型方程的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0 Trial軟件對表3中數據進行多元回歸擬合，得表4。

表4 回歸模型及其顯著性檢驗Table4 Test of the regression model and its signiciances

當P值小于0.05時，表示此項指標顯著，說明自變量和響應值之間線性關系顯著。各因素經回歸擬合后，得回歸方程：

其中，Y為提取率，A為料液比，B為乙醇質量分數，C為溫度。

由方差分析結果可知，該回歸方程呈極顯著性（P＜0.01），模型失擬項也呈極顯著性（P＜0.01）。B、C2對綠原酸提取率的影響極顯著（P＜0.01），B2對綠原酸提取率的影響顯著（P＜0.05），A、C、AB、AC、BC、A2對綠原酸提取率的影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 響應曲面分析

根據回歸分析結果，做出響應面圖，如圖6～8所示。由圖6可知，在各料液比中，隨著乙醇質量分數的增加，綠原酸的提取率開始快速增加而后減緩。由圖7可知，在各料液比中，隨著提取溫度的增加，綠原酸的提取率先上升后下降，可能是由于綠原酸為熱敏性物質，隨著溫度的升高綠原酸分解，從而導致提取率下降。由圖8可知，在乙醇質量分數較低時，隨著溫度的增加綠原酸的提取率先上升后下降；在乙醇質量分數增大為40%～60%時，提取率達最大；隨著乙醇質量分數的進一步增加，持續提高溫度，提取率下降。

圖6 料液比和乙醇質量分數對綠原酸提取率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio and ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

圖7 料液比和提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

圖8 乙醇質量分數和提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.8 Effect of ethanol mass fraction and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

2.2.4 提取工藝條件檢驗

考慮到實際情況，將提取工藝條件修改為料液比1∶11，乙醇質量分數40%，提取溫度61 ℃。采用修正條件進行試驗，得綠原酸實際提取率為0.870 8%，與0.872 8%相比，相差0.23%，說明此方程與實際情況擬合良好，所建模型可靠。

3 結論與討論

通過響應面優化杜仲葉中綠原酸的提取工藝，獲得最佳提取條件：料液比1∶11、乙醇質量分數40%、提取溫度61.42 ℃。在此工藝條件下綠原酸提取率為0.872 8%。3個工藝條件對綠原酸提取率影響程度由大到小依次為乙醇質量分數、料液比、提取溫度。考慮到實際操作的限制，將提取工藝條件參數修改為料液比1∶11，乙醇濃度40%，提取溫度61 ℃。采用修正條件進行試驗，結果與理論預測值基本一致。

為了進一步提高杜仲葉中綠原酸的提取效率，除了微波和超聲波輔助外，還可以通過一些生物技術來改善提取效果。如陳曉娟等[24]分別通過酶法和半仿生法從杜仲葉中提取綠原酸，提取率達到1.44%和1.29%；劉藝等[25]通過超臨界流體萃取綠原酸，避免了提取過程中高溫氧化分解綠原酸；余少沖等[26]采用罐組動態逆流提取技術提取綠原酸，提取率是傳統單罐提取的2.3倍。溫度對綠原酸的穩定性和提取效率起到雙重影響的作用，一方面，溫度的維持不利于綠原酸的穩定，另外一方面，升高溫度有利于提高綠原酸的表觀活化能，加快綠原酸擴散至杜仲葉顆粒表面，增加其在溶劑中的溶解度，進而提高綠原酸提取率[27]。因此，還需進一步探討溫度和乙醇對綠原酸的浸出動力學原理，綠原酸粗提工藝也需要向精提工藝轉變。

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