山杏體細胞胚胎發生及其組織學觀察

何炎紅，吳高殷，白玉娥，田 春

（1.內蒙古農業大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010020；2.內蒙古自治區中醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010010）

山杏Armeniaca sibirica是內蒙古干旱、半干旱地區沙地及山地主要的鄉土樹種，具有較大的實用價值，包括食用價值、園林綠化和醫藥價值等[1]，其產業發展在本地區生態建設和經濟建設中具有重要意義。而山杏的常規繁殖為播種和嫁接[2]，繁殖速率慢、周期長。近些年，隨著生物技術的發展及其在林業上的應用，一些針葉闊葉樹種通過非常規繁育方法獲得了完整的再生植株，例如植物組織培養、體細胞胚胎發生和人工種子等。體細胞胚胎發生通過胚性愈傷組織的誘導、增殖和分化成熟后可得到數量多、大小一致的胚狀體。關于林木的體細胞胚胎發生研究也取得了一些成果，例如馬尾松、云杉和文冠果[3-6]。本文中研究了山杏莖尖體細胞胚胎發生發育的過程，并對影響山杏胚性愈傷組織誘導的因素進行探討，旨在建立山杏體細胞胚胎發生體系，為后期的人工種子的制作、新品種遺傳改良、種資創新和縮短育苗周期提供技術和理論材料。

1 材料與方法

1.1 莖尖愈傷組織的誘導

以內蒙古呼和浩特市內蒙古良木繁育基地山杏種植區的山杏莖尖作為外植體。莖尖清洗消毒后，剝取約2 mm莖尖，并轉移到培養基。以MS為基本培養基，附加6-BA（0.5、1.0 mg/L），NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L） 和 2,4-D（0.1、0.2、0.5 mg/L）。在(25±2) ℃、暗光下進行培養。每隔7 d觀察愈傷組織的誘導及生長情況。

1.2 莖尖胚性愈傷的繼代與增殖

篩選出胚性愈傷組織進行增殖培養，每組培養基中添加6-BA（0.5 mg/L）和2,4-D（0.2 mg/L），然后分別添加0.5 g/L水解乳蛋白，0.5 g/L水解酪蛋白和0.5 g/L肌醇3種附加物。在(25±2)℃、暗光下進行培養。每隔7 d觀察愈傷組織的增殖率及生長情況。

1.3 莖尖胚性愈傷組織的細胞結構觀察

材料取自莖尖誘導出的愈傷組織，從誘導期直至胚性愈傷分化，每隔7 d定期取樣。將愈傷組織樣品放入FAA固定液中固定24 h以上，采用石蠟法制作切片，用Leica光學顯微鏡觀察切片。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對山杏莖尖愈傷組織誘導的影響

剝取的莖尖在6-BA與NAA和6-BA與2,4-D的處理組合下誘導愈傷組織，其愈傷組織誘導率及生長情況見表1。6-BA與2,4-D的組合中，隨著分裂素增加，愈傷組織分裂速率加快，且愈傷組織的數量較多，6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L組合時，誘導率高達88.0%，四周愈傷呈白色顆粒狀，但生長后期褐化嚴重，需要及時更換培養基進行繼代增殖培養；當6-BA質量濃度為1.0 mg/L時，增加NAA質量濃度，愈傷組織誘導率呈下降趨勢；當6-BA質量濃度為0.5 mg/L、NAA質量濃度為0.2 mg/L時，莖尖愈傷組織誘導率高達100%，愈傷組織的數量較多呈白色透明小顆粒（見圖1）。所以選取MS+6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）為最佳莖尖愈傷組織誘導培養基。

表1 不同激素配比對莖尖愈傷組織誘導的影響Table1 Effects of different hormone combinations on callus induction from stem tips

圖1 莖尖愈傷組織的誘導Fig.1 Callus induction from stem tips

2.2 不同附加物對山杏胚性愈傷組織增殖的影響

不同附加物對山杏胚性愈傷組織增殖的影響見表2。由表2可知，附加物水解乳蛋白、水解酪蛋白和肌醇處理的愈傷增殖率均超過80%，在添加水解酪蛋白的培養基中增殖率最高，達92.2%，且愈傷增殖量也較多，隨著培養時間增加，在外植體自身代謝產物和培養基不斷減少的因素制約下，部分愈傷組織不增殖或者褐化死亡（見圖2）。對增殖率進行方差分析，結果見表3。由表3可看出，不同附加物對愈傷組織增殖的影響間差異不顯著。

2.3 山杏體細胞胚胎發生形態學觀察

在對山杏莖尖胚性愈傷組織進行增殖和分化誘導期間，定期取樣，放進FAA固定液中固定24 h，進行石蠟切片觀察（見圖3）。由圖3可以看出，在山杏體細胞胚胎發生過程中能明顯看出球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚等階段。

表2 不同附加物對胚性愈傷組織增殖的影響Table2 Effects of different additives on embryonic callus proliferation

圖2 胚性愈傷組織的增殖Fig.2 Embryonic callus proliferation

表3 不同附加物對胚性愈傷組織增殖影響的方差分析?Table3 Variance analysis of effects of different additives on embryonic callus proliferation

圖3 山杏體細胞胚胎發生組織學觀察Fig.3 Histological observation of somatic embryogenesis processes in A. sibirica

3 結論與討論

在激素6-BA質量濃度為0.5 mg/L、NAA質量濃度為0.2 mg/L時，山杏莖尖愈傷組織誘導率高達100%，從中篩選胚性愈傷組織進行增殖培養。在胚性愈傷組織增殖培養基中添加附加物水解乳蛋白、水解酪蛋白和肌醇，添加水解酪蛋白處理的愈傷增殖率最高，為92.2%。在山杏體細胞胚胎發生過程中能明顯看出球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚等階段。其體細胞胚胎發生機理還需在分子水平深入探討。

在山杏組織培養過程中，以6-BA和IBA為激素組合的研究報道較為常見，且在愈傷組織誘導初期6-BA的適宜濃度相對較高[7]，這一論點與本文的結果一致。本研究中，在山杏莖尖胚性愈傷誘導和增殖過程中均添加了激素2,4-D，在胚性愈傷組織分化的過程中，愈傷分化率極低且分化苗長勢較弱[8-10]，這與朱華國等[11]對棉花體細胞胚胎發生的研究結果基本一致，即2,4-D能夠使細胞快速完成脫分化過程，使得愈傷快速增殖并產生大量細胞質豐富的細胞，但同時由于其效應過強，僅有少量前胚性細胞團能夠從大量的細胞質豐富的細胞轉化過來，限制了前胚性細胞團的產生，從而進一步限制了胚性愈傷向體細胞胚的轉化，出現了細胞質豐富的細胞多但分化率低的現象。Aung Htay Naing等[12]在對Chrysanthemum cv. Euro體細胞胚的研究中指出在同時使用細胞分裂素（BA、TDZ和KN）和2,4-D的情況下可以誘導體細胞胚發生，但僅使用2,4-D時體細胞胚不發生。研究認為體細胞胚不發生與前期培養中長期使用2,4-D有關[8-9]，因此為了促進胚性愈傷組織發生，在培養中應降低2,4-D濃度或者不使用2,4-D。

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