棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌抗藥性研究

張 敏 ，王 迎 ，史曉夢 ，田紅雨 ，甄志先 ，冉隆賢

（河北農業大學a.林學院；b.河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室，河北 保定 071000）

棗縮果病是棗生產中最嚴重的果實病害，現已遍及全國各大棗區。受害的棗果由外向內逐漸出現褐色壞死現象，病組織呈海綿狀[1]，于成熟前脫落[2]，無商品價值。據報道，互隔鏈格孢菌是引起棗縮果病的初侵染病原菌[3]，該病害在河北、河南、山東和山西各大棗區均有大面積爆發的報道[4]，嚴重影響了棗的品質和產量。

棗縮果病以化學防治為主[5]。許陽等的試驗結果表明，異菌脲有明顯的防治效果[6]；邢藝林等研究認為，異菌脲和苯甲丙環唑均有明顯的防治效果[7]。但是，已有關于生產中存在鏈格孢屬真菌對異菌脲產生抗藥性問題的研究報道。Mcphee研究發現了抗異菌脲的互隔鏈格孢菌突變體[8]；黃思良從自然界中分離得到了抗異菌脲的互隔鏈格孢菌突變體菌株[9]；Simoneau等報道，甘藍鏈格孢菌對二甲酰亞胺類殺菌劑有很強的抗性[10]；Ma從開心果中分離到了抗異菌脲的鏈格孢屬真菌[11]；其它植物病原菌對異菌脲的抗藥性也相繼被發現[12-17]。另外，互隔鏈格孢菌對甲基硫菌靈和腐霉利產生抗性也有報道[18-19]。

由此可見，長期單一噴施異菌脲易使鏈格孢屬真菌產生抗藥性，而棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌是否對異菌脲產生抗性尚未見諸報道。為此，本研究選取分離自未使用過異菌脲和苯甲丙環唑棗園的4株棗縮果病菌A. alternata[3]，分別測定了其對異菌脲和苯甲丙環唑的敏感性，從中篩選抗性菌株，并檢測其交互抗性。通過交互抗性的分析和林間防治效果的試驗，確定林間最適施藥方案，以期為棗縮果病菌抗藥性的風險評估和治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：互隔鏈格孢菌4個菌株CN191、CN192、CN193和CN194，分別于2011年分離自河南新鄭和濮陽、河北行唐和唐縣的病果。

供試藥劑：50%異菌脲可濕性粉劑，由美國富美實公司生產；50%苯甲丙環唑，由青島泰升生物科技有限公司生產。

1.2 方 法

1.2.1 棗縮果病菌對2種殺菌劑的敏感性的測定

采用生長速率法測定棗縮果病菌對異菌脲和苯甲丙環唑的敏感性。將互隔鏈格孢菌各菌株置于馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）上，25 ℃黑暗培養7 d以備用。在超凈工作臺上，用 0.7 cm 打孔器沿預培養7d的棗縮果病菌菌落邊緣打取菌碟，然后，將菌碟接種到分別含有0.002、0.010、0.020、0.100、0.200 mg·mL-1的 異 菌 脲 和 0.01、0.02、0.10、0.20、1.00 mg·mL-1的苯甲丙環唑的PDA培養基中央，每個處理重復3次。將接種后的培養皿放入25 ℃的培養箱中黑暗培養。當對照組菌落直徑達到30 mm時，采用十字交叉法測定菌落直徑，計算藥劑不同濃度處理對各互隔鏈格孢菌菌絲生長的抑制率[20]。求出毒力回歸方程y＝a＋bx，根據方程計算2種殺菌劑抑制各菌株菌絲生長的有效抑制濃度 EC50值（mg·mL-1）及相關系數 r。根據EC50值分析采自同一年份、不同地區的棗縮果病菌對這2種殺菌劑的敏感性。

菌絲生長抑制率(%)＝(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/(處理菌落直徑－0.7)×100%。

1.2.2 突變體菌株的篩選

在無菌環境下，用無菌水分別配制 100 mg·mL-1異菌脲和苯甲丙環唑母液以備用。制作含有不同濃度梯度的異菌脲和苯甲丙環唑藥劑的PDA培養基，其起始濃度設定為0.005 mg·mL-1，并依次將藥劑濃度提高到0.01、0.02、0.05、0.10、0.15和0.20 mg·mL-1。取濃度為 400 ～ 500 個·mL-1的孢子懸浮液100 μL，分別均勻涂布于含有異菌脲和苯甲丙環唑的培養基上，于25 ℃條件下培養。以涂布無菌水的PDA培養基作為對照。待含有0.005 mg·mL-1藥劑的PDA培養基上長出突變體單菌落后，再將突變體菌株轉接入PDA 培養基上培養，待其長出孢子后，配制濃度為400～500個·mL-1的孢子懸浮液，取100 μL接入含有相應高濃度的藥劑培養基中，依次重復，以培養菌株對異菌脲的抗性，最終得到抗異菌脲的突變體菌株CN194y。

1.2.3 突變體菌株的穩定性檢測

將突變體菌株CN194y在不含異菌脲的PDA培養基上連續培養5代后，用打孔器取直徑為0.7 cm的菌落塊，并以野生型菌株CN194為對照，將其分別接種到含有0.20 mg·mL-1異菌脲和不含異菌脲的PDA培養基中央，置于25 ℃培養箱中黑暗培養5 d后，測量菌落生長的直徑。

1.2.4 突變體菌株的致病性檢測

在河北農業大學苗圃，選擇無棗縮果病的試驗地作為接種地。將通過穩定性測試的突變體菌株CN194y的菌碟，刺傷接種在活體的棗果上。試驗設2個對照組，其中，第1對照組刺傷接種無菌的PDA培養基，第2對照組刺傷接種野生菌株CN194菌碟。發病后將病果帶回實驗室分離，并置于含有0.20 mg·mL-1異菌脲的PDA培養基上培養，觀察病原菌的生長狀況，判定是否為接入的突變體菌株CN194y。

1.2.5 突變體菌株對2種藥劑的交互抗性的測定

選取8個抗異菌脲的突變體菌株CN194y，檢測苯甲丙環唑對它們的毒力，用藥劑對菌株的EC50值表示毒力。分析異菌脲和苯甲丙環唑之間的交互作用。

1.2.6 林間防治試驗

將河北省行唐縣寺上村施用過異菌脲和苯甲丙環唑的試驗地分成9個小區，處理和對照各3個小區，隨機分布；2016年7月1日開始，在試驗地各小區內分別噴施異菌脲1 000倍液和苯甲丙環唑3 000倍液。選取未施用過異菌脲和苯甲丙環唑的試驗地，將其分成12個小區，處理和對照各3個小區，隨機分布；2017年6月28日開始，在各小區內分別噴施異菌脲1 000倍液、苯甲丙環唑3 000倍液和兩種殺菌劑交替施用。上述各試驗均每隔7 d噴藥1次，共噴施8次，對照噴施等量的清水。發病率的調查時間分別為發病初期和高峰期。各小區內隨機選取發病一致的3株棗樹，每個處理9株棗樹，每株棗樹選擇4個枝條進行調查，分別記錄噴藥棗樹的枝條及對照枝條的總果數和病果數，計算發病率和防治效果。

發病率(%)＝(病果總數/調查總果數)×100%；

防治效果(%)＝(對照病果率－處理病果率)/對照病果率×100%。

1.3 數據的統計與分析

根據記錄結果對數據進行反正弦轉換后，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，統計分析各處理平均值間的差異性，并用LSD 最小顯著差異法比較不同處理間的差異顯著性（α＝0.05或α＝0.01）。

2 結果與分析

2.1 棗縮果病菌對2種殺菌劑敏感性

異菌脲和苯甲丙環唑2種藥劑的毒力回歸方程和有效中濃度分別見表1和表2。由表1和表2可知，CN191、CN192、CN193和CN194這4個菌株對異菌脲和苯甲丙環唑的敏感趨勢相同，其中，CN194對這2種藥劑的敏感性最強，CN192對這2種藥劑的敏感性最差。異菌脲和苯甲丙環唑的處理濃度與抑制效果間均呈正相關，其相關系數分別在0.91和0.94以上。

表1 異菌脲的毒力回歸方程和有效中濃度Table1 Virulence regression equations and median effective concentrations of iprodione

表2 苯甲丙環唑的毒力回歸方程和有效中濃度Table2 Virulence regression equations and median effective concentrations of benzoyl propiconazole

2.2 突變體菌株的篩選及穩定性

用異菌脲和苯甲丙環唑分別處理CN194，篩選獲得能抗0.20 mg·mL-1異菌脲的突變體CN194y。將CN194y接種到無異菌脲的培養基上繼代培養5代后，重新接回到含有異菌脲的培養基上，得到穩定的抗異菌脲突變體菌株CN194y。在無異菌脲的PDA培養基上，25 ℃培養5 d后，野生型菌株CN194和突變體菌株CN194y的菌落塊直徑分別為（5.30±0.07）和（5.30±0.06）cm，二者間無差異。在含有0.20 mg·mL-1異菌脲的PDA培養基上，相同條件下培養5 d后，CN194y菌落塊直徑為（5.00±0.12）cm，其與在無異菌脲培養基上培養的CN194y的菌落塊直徑間沒有顯著差異（P＞0.05）；野生型菌株CN194在含有0.20 mg·mL-1異菌脲的PDA培養基上不能生長。此結果表明，抗異菌脲突變體菌株CN194y的突變特征明顯且穩定。

2.3 突變體菌株的致病性

CN194y林間接種后可導致棗果發病（圖1A），接種部位出現紅褐色凹陷的病斑，果肉病組織呈土黃色海綿狀壞死，于成熟前脫落，且與CN194自然狀態下致病癥狀相同（圖1B），說明CN194y的致病性沒有變化。

2.4 突變體菌株對2種藥劑的交互抗性

圖1 抗異菌脲突變體菌株CN194y與野生型菌株CN194林間刺傷接種棗果的發病癥狀Fig.1 Symptoms of jujube fruits inoculated through stab-wound with iprodione-resistant mutant strain CN194y and wild type strain CN194

將抗異菌脲突變體菌株CN194y分別接種在含有不同濃度苯甲丙環唑的培養基上，根據菌落直徑測得的毒力回歸方程為y＝1.308 4x＋8.865 4，EC50值為0.0011mg·mL-1，其相關系數為0.983 4，與野生型菌株 CN194的 EC50值（0.0013mg·mL-1）間的差異性不顯著（P＞0.05）。此結果表明，異菌脲和苯甲丙環唑之間無交互抗性。

2.5 林間噴施2種藥劑的防治效果

河北省行唐縣寺上村施用過異菌脲和苯甲丙環唑棗園林間防治效果的調查結果見圖2。2016年9月2日在發病初期進行第1次調查，異菌脲與苯甲丙環唑的防治效果分別為44.4%和83.3%；同年9月24日發病高峰期進行第2次調查，異菌脲和苯甲丙環唑的防治效果分別為30.8%和51.3%。兩次調查結果中，施用苯甲丙環唑與對照間均有顯著性差異（P＜0.05），而異菌脲的防治效果與對照間無顯著差異（P＞0.05），在施用過異菌脲和苯甲丙環唑的棗園內，苯甲丙環唑的防治效果無論在發病初期還是后期都好于異菌脲。

圖2 2016年棗縮果病藥劑的防治效果Fig.2 Control effects of fungicides on jujube shrunken-fruit disease in 2016

河北省行唐縣寺上村未施用過異菌脲和苯甲丙環唑棗園林間防治效果的調查結果見圖3。2017年8月29日在發病初期進行第1次調查，結果表明，異菌脲、苯甲丙環唑和這2種藥劑交替施用的防治效果分別為92.9%、57.1%和61.9%，這3種施用方法的防治效果與對照間均有顯著性差異（P＜0.05），其中，異菌脲、苯甲丙環唑和這2種藥劑交替施用的防治效果間有顯著性差異（P＜0.05）。同年9月18日在發病高峰期進行第2次調查，結果表明，異菌脲、苯甲丙環唑和這2種藥劑交替施用的防治效果分別為68.4%、47.4%和52.6%，這3種施用方法的防治效果與對照間均有顯著性差異（P＜0.05），但3種施用方法的防治效果間的差異性不顯著（P＞0.05）。綜合來看，在未施用過異菌脲和苯甲丙環唑的棗園內，異菌脲無論在發病初期還是后期都顯示有較好的防治效果，且在發病初期的防治效果尤為突出。綜合兩種試驗結果，2種藥劑交替施用將有助于避免病菌抗藥性的產生。

圖 3 2017年棗縮果病藥劑防治效果Fig.3 Control effects of fungicides on jujube shrunkenfruit disease in 2017

3 結論與討論

不同地區棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌對異菌脲和苯甲丙環唑的敏感性有差異，但敏感趨勢相同；互隔鏈格孢菌對異菌脲易產生抗藥性，而對苯甲丙環唑不易產生抗藥性，且2種藥劑之間不產生交互抗性。雖然林間施藥時異菌脲的防治效果好于苯甲丙環唑，但綜合室內和林間試驗結果來看，長時間單一施用異菌脲會使互隔鏈格孢菌產生抗藥性，且抗性會逐年提升，影響防治效果；而苯甲丙環唑的林間防治效果穩定，且室內未篩選出抗苯甲丙環唑的互隔鏈格孢菌突變體。因此，林間防治棗縮果病應做好相關監測工作，將異菌脲和苯甲丙環唑交替施用，以延緩病菌抗藥性的產生。

調查中發現，在連續施用過異菌脲和苯甲丙環唑的棗園內，異菌脲的防治效果較苯甲丙環唑差；在未施用過這2種藥劑的棗園內，異菌脲的防治效果較苯甲丙環唑好，這與王海強[20]和陳帥民[12]的研究結果一致。異菌脲和苯甲丙環唑的防治效果稍遜于邢藝林的防治試驗效果[7]，可能是由施藥時間推遲了15 d所致。趙樂研究認為，棗縮果病菌可在花期侵入[21]；王森的研究結果表明，棗樹花期較長，各品種花期約1～2個月[22]，因此，在初花期施藥效果最佳。據李新鳳研究報道，向日葵菌核病菌抗腐霉利的突變體菌株僅對同屬二甲酞亞胺類殺菌劑的異菌脲有正交互抗性，而對百菌清、多菌靈和福美雙等均無交互抗性[16]。本研究結果表明，交替施用2種不同類型的藥劑，也不產生交互抗性，這與上述報道的研究結果一致。

異菌脲為二甲酰亞胺類殺菌劑，Orth等認為，此類殺菌劑可誘導菌體產生還原態的氧自由基，從而引起改變細胞膜通透性等一系列破壞細胞的連鎖反應[23]。苯甲丙環唑有效成分為丙環唑與苯醚甲環唑，是甾醇脫甲基化抑制劑 ，能夠通過抑制細胞壁甾醇的生物合成來阻止真菌的生長[24]，但王海強等人的研究結果表明，二甲酰亞胺類殺菌劑的內吸性較差，抗性風險較高，應作為保護性藥劑使用，且盡量與其它類型的藥劑輪換使用[20]。在生產實踐中，在使用異菌脲防治由鏈格孢菌引致的病害時，已發現了多個對異菌脲產生抗性的菌株[8-11,13,25-26]；在其它病原菌對殺菌劑的抗性及各殺菌劑間交互抗性的研究報道中，已見有多種殺菌劑易產生抗性的報道，且部分殺菌劑與其它殺菌劑間有正交互抗性[27-29]。本研究未發現鏈格孢菌對苯甲丙環唑產生抗性。但是，由于殺菌劑的種類較多，每年在棗縮果病發生時，農戶盲目用藥，有病亂投醫現象突出，因此，有必要繼續探索與異菌脲作用機理不同的殺菌劑，并進行輪換施用，同時，應對防治棗縮果病的其它殺菌劑進行抗性監測及交互抗性研究，從而為持續控制棗縮果病提供技術支持。

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